神经病理性疼痛，是由躯体感觉神经系统的损伤及疾病引起的一系列疼痛的总称，有报道称兴奋性突触传递的增加可通过躯体感觉途径如脊髓、前扣带皮层（anteriorcingulatecortex，ACC）引起外周痛觉超敏[1]。长时程抑制（long-termdepression,LTD）是中枢神经系统突触可塑性的另一重要模式，LTD与学习记忆、感觉信息处理及神经系统疾病有关。Caspase3（Casp3）分子的非凋亡功能参与AMPA受体的内化过程及LTD的诱导，Casp3可能以两种方式调控AMPA受体亚基的内化：一是裂解AKT1或GAP43，进而影响AMPA受体亚基的表达；二是直接裂解GluA1亚基。然而其具体的机理尚不清楚。
年11月10日，浙江大学脑科学与脑医学学院罗建红、李相尧教授团队及上海交通大学医学院解剖学与生理学系徐天乐教授团队合作在《CellReports》杂志发表题为RestorationofCingulateLong-TermDepressionbyEnhancingNon-apoptoticCaspase3AlleviatesPeripheralPainHypersensitivity的最新研究论著[2]，揭示了Casp3通过与AMPA受体亚基的相互作用参与了前扣带回皮层LTD，阐明了Casp3分子的非凋亡功能与前扣带回皮层LTD以及神经病理性疼痛之间的作用机制。
结果
01
Casp3参与周围神经损伤抑制ACC脑区LTD诱导过程
首先，作者在成年雄性小鼠上构建腓神经结扎模型（peronealnerve,CPN）[3]，发现，CPN结扎可显著降低机械缩足反应阈值（pawwithdrawalthreshold,PWT），同时，在术后7天记录ACC的场电位发现，周围神经损伤减弱了ACC中长时程抑制（long-termdepression,LTD）的诱发（图1A-C）。AMPA受体（AMPAR）的内化过程参与LTD的诱发表达，AMPAR的内化则需要激活Caspase3（Casp3）[4-6]。因此，为了明确周围神经损伤抑制LTD诱发的机制，研究人员先验证了Casp3是否参与ACC中LTD的诱发。他们在ACC中检测到了Casp3阳性神经元（图1D），此外，借助Casp3抑制剂（Z-DEVD-FMK）发现，在低频电刺激（low-frequencystimulation,LFS；1Hz）前20min给予抑制剂，可阻断LTD的诱发，但不影响长时程增强（long-termpotentiation,LTP）的诱导（图1E,F）。同时，给予脑切片Casp3激活剂（cisplatin）处理后，突触后致密物（postsynapticdensities,PSDs）中GluA1和GluA2蛋白亚基（编码AMPA受体的重要基团）含量显著下降，这一现象可被Casp3抑制剂所逆转（图1G,H），这进一步提示了，Casp3在调节AMPAR内化过程中的重要作用。
图1周围神经损伤抑制LTD的诱发，Casp3参与ACC中LTD的诱发过程
02
Casp3通过高度保守序列—D与AMPA受体亚基发生相互作用
基于图1的数据，Casp3在PSDs中调控AMPAR亚基，提示了Casp3可能在兴奋性突触中表达。同时，借助免疫电镜技术（immuno-electronmicroscopy，IEM）发现Casp3同时存在于ACC兴奋性突触前和突触后区域（图2A）。为明确Casp3和AMPAR亚基之间存在相互作用关系，作者进一步借助caspase数据库、免疫共沉淀（co-IP）技术及电生理记录发现，在AMPAR亚基中高度保守序列—D介导了Casp3和AMPAR亚基之间的相互作用，因此借助D阻断两者之间的相互作用可抑制AMPAR的内化及LTD诱发（图2）。
图2D序列可部分阻断Casp3和AMPAR亚基之间的相互作用
03
神经损伤影响Casp3外源性调控通路
Westernblotting结果显示，CPN结扎后第7天和第14天ACC中正常状态下和活化后的Casp3含量均显著下降（图3A-C）。进一步，研究人员探讨了在周围神经损伤后Casp3调控通路是否也发生了改变。Casp3所调控的细胞凋亡可由两种方式进行调控：外源性途径（Extrinsicpathway）和内源性途径（Intrinsicpathway）[7]。外源性途径是通过配体与细胞表面受体结合，如TFN受体1（TNFR1）和死亡受体Fas/CD95，在FADD（Fas偶联死亡区域蛋白Fas-associateddeathdomainprotein）的协助下，FADD的死亡效应区和Caspase8酶原结合，随后通过高密度自催化激活自身，活化后的Caspase8激活下游的Caspase3，导致细胞凋亡（图3D）。作者检测了CPN结扎后不同时间点的扣带皮层中Fas、TNFR1和Casp8的表达，结果发现，发现TNFR1和Fas从周围神经损伤后第7天开始表达下调（图3E,F），而Casp8从第14天开始下降（图3G）。内源性途径源于DNA损伤，导致线粒体膜通透性改变，释放出细胞色素C（CytochromeC），激活Casp9，进而去调控下游Casp3（图3D）。Westernblotting结果显示，周围神经损伤后ACC中Casp9（图3H）和细胞色素C（图3I）含量无明显变化。这提示了，CPN结扎可能影响ACC中Casp3调控通路的外源性途径。
图3周围神经损伤导致Casp3表达下调及其调控的外源性途径改变
04
Casp3下调抑制LTD
接下来，作者验证了Casp3的表达下调对于周围神经损伤导致LTD抑制的作用。研究人员设计了Casp3的特异性shRNA，并借助慢病*载体（Lenti-CMV-EGFP-U6-Casp3shRNA）在小鼠ACC中特异性下调Casp3的表达（图4A,B），同时发现，Casp3表达下调后可明显抑制LTD诱导（图4C,D）。进一步，研究人员同样借助慢病*载体（Lenti-hSyn-Casp3-mCherry）特异性在ACC中过表达Casp3（图4E），病*注射10天后进行CPN结扎，一周后区ACC脑片观察发现，ACC脑区Casp3表达升高后逆转了CPN结扎导致的LTD诱导受到抑制的现象（图4F-H）。
图4Casp3含量变化改变了ACC中LTD的诱导
05
Casp3下调增强AMPA受体介导的突触传递
随后，作者探究了Casp3表达下调是否会影响突触增强。Westernblotting结果显示，CPN结扎导致PSDs中GluA1水平升高（图5A），同时，注射Lenti-CMV-EGFP-U6-Casp3shRNA的小鼠PSDs中GluA1和GluA2水平也升高（图5B），全细胞膜片钳记录显示，自发性兴奋性突触后电流（spontaneousexcitatorypostsynapticcurrents,sEPSCs）的振幅明显升高，而频率无明显变化（图5C-E），这提示了，Casp3的表达下调增加ACC中AMPAR介导的电流。有意思的是，周围神经损伤后，ACC脑区中Casp3的过表达使PSDs中GluA1和GluA2含量下降（图5F），全细胞膜片钳记录显示，CPN结扎后Casp3过表达导致sEPSCs的平均振幅下降（图5G-I）。CPN结扎组和对照组AMPAR介导的输入/输出电流曲线存在显著差异，而ACC脑区Casp3过表达则消除了这种差异（图5K,L），这提示了Casp3的过表达有效阻止了损伤导致的ACC兴奋性突触中功能AMPARs的上调。
图5ACC脑区Casp3的表达下调增强了AMPAR电流，同时，Casp3的过表达可逆转CPN结扎导致的突触传递增强现象
06
过表达Casp3可缓解神经损伤后的痛觉过敏
最后，作者探讨了Casp3的下调是否会导致类似的慢性疼痛表型。研究人员借助VonFrey纤维细丝触痛仪检测机械性痛觉超敏（mechanicalallodynia,一种与慢性疼痛相关的病理现象），发现下调Casp3表达可降低小鼠机械缩足反应阈值（pawwithdrawalthreshold,PWT）（图6A）。自发性疼痛（Spontaneouspain）是另一种与慢性神经疼痛相关的病理表象，研究人员借助条件性位置偏爱行为学范式发现，腹腔注射肾上腺素能受体a2亚基激动剂可诱导ACC中Casp3敲低小鼠的位置偏好（图6B）。同时，作者还探讨了干扰AMPAR内化是否会导致外周过敏反应（peripheralhypersensitivity），将D作用于野生小鼠ACC脑区，可降低小鼠PWTs，并显著诱导小鼠条件性位置厌恶（conditionedplaceaversion,CPA）（图6C,D）。上述结果显示，过表达Casp3可降低了神经损伤后兴奋性突触传递，保护LTD诱导，基于此，作者研究了Casp3的高表达是否会影响神经损伤后的疼痛表现，结果显示，Casp3的表达上调并未改变小鼠的PWTs（图6E,F），但可改善CPN结扎后的冷触诱发痛（图6G,H），提示了，Casp3可改善小鼠的痛觉过敏。此外，CPN结扎后，肾上腺素能受体a2亚基激动剂可诱导小鼠的位置偏好，这一现象也可被高表达的Casp3所逆转（图6I），提示了Casp3也可改善自发性疼痛。此外，作者通过Ca2+渗透型AMPAR（CP-AMPARs）选择性抑制剂处理后发现，CPN结扎小鼠在抑制剂处理1h后表现出PWTs升高及位置偏好现象（图6K,L），这些数据表明，经CP-AMPARs抑制剂处理可逆转神经损伤引起的AMPARs活性增强现象。
图6过表达Casp3可缓解神经损伤后的痛觉过敏
结论
本篇文章结合病*载体介导的基因过表达/干扰、膜片钳电生理、免疫电镜、免疫共沉淀、行为学等多种技术手段发现，Casp3通过与AMPA受体亚基的相互作用参与了前扣带回皮层LTD，Casp3的下调抑制了ACC中的LTD诱发，导致痛觉过敏，而过表达Casp3可降低神经损伤后的外周痛觉过敏现象。这些研究阐明了Caspase3分子的非凋亡功能与前扣带回皮层LTD以及神经病理性疼痛之间的作用机制，为治疗神经病理疼痛提供新方向！
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参考文献
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[2]Yong-JieWang.etal.,().RestorationofCingulateLong-TermDepressionbyEnhancingNon-apoptoticCaspase3AlleviatesPeripheralPainHypersensitivity.CellRep.Nov10;33(6):.doi:10./j.celrep...
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