中华耳科学杂志,年19卷1期
天麻素对前庭功能障碍大鼠前庭内侧核组胺受体表达的影响姜宇晴张琦张业慧高梅傲冷辉
人体平衡由前庭系统、本体感觉系统和视觉系统共同维持，与中枢神经系统密切联系，而前庭系统起主导作用。前庭功能障碍发病率高、临床症状严重，约有35%[1]成人患有需要治疗的前庭功能障碍。前庭代偿机制的研究对于促进中枢神经系统前庭功能的恢复和了解损伤后的功能可塑性具有重要意义。其中药物治疗方案目前尚无统一标准，且鲜有中药单体治疗此病者。
天麻素为天麻的主要成分之一，化学名称为4-羟甲基苯基-β-D-吡喃葡萄糖甙，具有镇静、神经保护、改善微循环等作用[2]；可透过血脑屏障直接作用于中枢神经系统[3]。在天麻的代谢机制研究进展中发现其可平衡大脑皮层的兴奋与抑制过程，用于眩晕病的治疗[4]。因此，天麻素的促进前庭代偿作用及机制的研究是耳科学前庭康复领域的一项重要课题。
本研究通过UL诱导前庭功能障碍大鼠模型，然后给予不同剂量的天麻素干预，通过检测大鼠MVN中组胺H1、H2、H3受体基因和蛋白表达水平的变化，探讨天麻素对前庭功能障碍大鼠的干预作用及机制，为天麻素应用于前庭功能障碍疾病提供理论依据。
1实验材料
1.1实验动物
SPF级SD大鼠99只，体重g～g，雌雄不限，由辽宁长生生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(辽)-。动物购入后，饲养于SPF级动物饲养室内，适应性饲养一周后用于正式实验。
1.2实验药品及试剂
天麻素（国药准字：H），昆明制药集团股份有限公司生产；氯仿（批号：T），国药集团化学试剂有限公司生产；DAB试剂盒（AR），武汉博士德公司生产；BeyoECLstar（PAS）、Western及IP细胞裂解液（P），广州碧云天公司生产；HRH1PolyclonalAntibody（PA5-），ThermoFisher公司生产；RabbitAnti-HRH2(bs-R)、RabbitantiGAPDH（bs-OR），北京博奥森生物技术有限公司生产；Anti-HRH3/H3R(ab)、HRPGoatAntiRabbit（ab），Abcam公司生产。
1.3仪器设备
全自动酶标仪（anthos型），奥地利AnthosLabtecInstruments；恒温水浴振荡器（SHA-B型），常州国华电器有限公司；电泳仪（EPS型）、凝胶成像分析系统（SF型），上海天能科技有限公司；荧光定量PCR仪（ACN），赛默飞世尔科技公司。
2实验方法
2.1实验分组
将99只健康SD大鼠按随机数字表法分为空白对照组（n=9）、假手术组（n=18）、造模组（n=72）。模型复制成功后，将造模组大鼠随机分为4组：模型对照组（n=18）、天麻素高剂量组（n=18）、天麻素中剂量组（n=18）、天麻素低剂量组（n=18）。
2.2造模方法
空白对照组正常饲养，造模组左侧鼓室内注射氯仿（50%）0.1-0.2ml/耳，假手术组则注射生理盐水[5]。术后0.5h，观察大鼠行为学特征及失衡行为，进行模型评价。
2.3模型评价2.3.1行为学特征及失衡行为评分
UL后造模组大鼠出现单侧前庭外周感受器损毁的行为学表现特征：自发性眼震，一侧倾倒、头身偏斜等失衡行为。参考Petrosini报告的方法[6]对头偏、躯干卷曲、肢体外展、强迫环形运动和眼震样头震等5个失衡症状分别评分，症状最严重记2分，症状消失记0分，总分在0-10分之间。在术后0.5h时间点对六组大鼠进行失衡行为的评分及头偏斜测量。
2.3.2空间姿势反射
将大鼠置于海绵垫上约50cm的高度，呈仰卧位，使其自由下落，观察下落过程：阴性表现为四肢着地，俯卧在海绵垫上。当出现身体一侧或背部着地则视为阳性表现。
2.3.3自发性眼震检测
将大鼠两眼外眦部和头顶部充分脱毛后，将导电膏置于Ag-AgCl盘状电极中并贴于两眼外眦部，参考电极置于头顶部，使用日本光电株式会生产的记录系统在暗室记录大鼠术后0.5、4、12、24、48h等几个时间点自发性眼震频率变化过程。
2.4干预方法
空白对照组：正常饲养，不作处理。
假手术组、模型对照组：术后1h，大鼠肌注生理盐水（75mg·kg-1·d-1），日1次，连续3天。天麻素高、中、低剂量组：术后1h，大鼠分别肌注天麻素注射液（mg·kg-1·d-1）、（75mg·kg-1·d-1）、（50mg·kg-1·d-1），日1次，连续3天。
2.5样本采集
给药至第3天，末次给药后1h，空白对照组随机抽取3只，其余各组中随机抽取6只，过量麻醉法处死大鼠，取全脑组织，浸泡于4%多聚甲醛溶液中，室温固定，用于免疫组织化学法检测。
剩余大鼠过量麻醉法处死，取全脑置于冰面上，空白对照组分离双侧MVN组织，其余组分离左侧MVN组织，所有MVN2等分，一份直接冻存于-80℃冰箱中，用于Western-Blot检测；另一份加入0.5mlTrizol再冻存，用于RT-PCR检测。
2.6指标检测
2.6.1免疫组化法检测各组大鼠MVN中组胺受体
H1、H2、H3亚型的表达水平常规制备石蜡切片，脱蜡并水化，柠檬酸盐缓冲液中抗原修复20分钟，滴加正常山羊血清封闭10min，倾去封闭液，勿洗。加一抗（1:稀释）4℃孵育过夜。次日复温1h，洗片后加二抗工作液，37℃孵育60min，PBS洗涤，5次×5min，DAB显色3min，自来水冲洗，苏木素复染30s-1min，1%盐酸乙醇分化10-30s，自来水冲洗。中性树胶封片，数码显微镜下观察并采集照片,采用生物信号采集系统测定平均光密度值作为该例样本目的蛋白相对表达水平进行统计分析。
2.6.2RT-PCR法检测各组大鼠MVN中组胺受体H1、H2、H3亚型的表达水平
Trizol裂解法提取组织中总RNA，测定浓度及质量后，采用一步法RT-PCR试剂盒检测组胺受体H1、H2、H3mRNA的表达水平。引物序列详见表1。经ABIPrismHT序列检测系统检测出CT值，△CT=CT目的基因-CT内参,△△CT=△CT实验-△CT对照,根据计算公式：△△CT值＝（靶基因CT值－内参CT值）处理组－（靶基因CT值－内参CT值）未处理组，用2-ΔΔCT表示靶基因的表达相对于内参基因的改变倍数，即相对表达量，并进行统计分析,详见表1。
2.6.3Western-Blot法检测各组大鼠MVN中组胺受体H1、H2、H3亚型的表达水平
裂解法提取总蛋白，蛋白定量后变性，50ug蛋白量进行垂直电泳，湿转法将蛋白转印至PVDF膜，将PVDF膜以5%BSA温室封闭1h，然后一抗（稀释度为1:）4℃孵育过夜。次日取出复温1h，去除抗体，TBST洗膜6次×5min。HRP标记的二抗（稀释度为1:）37℃孵育2h，去除二抗，洗膜6次，ECL发光并采集照片，测定目的蛋白条带和内参条带的灰度值，并以目的条带灰度值/内参条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达水平，进行统计分析。
3统计学方法
采用SPSS22.0统计软件对实验数据进行单因素方差分析，以均数±标准差（x±s）表示，以P＜0.05为有统计学差异。
4结果
4.1模型评价
4.1.1一般状态观察
造模组大鼠在术后麻醉清醒后，出现明确的前庭功能损伤的失衡行为。假手术组无相关症状出现。如图1，表2。
4.1.2空间姿势反射
空白对照组和假手术组空间姿态反射均为阴性；而其余四组空间姿态反射均为阳性。
4.1.3自发性眼震检测
记录大鼠术后0、4、12、24、48h等几个时间点自发性眼震频率变化过程，可见高剂量天麻素降低自发性眼震频率效果最佳。详见表3。
4.2免疫组化法检测MVN中组胺受体H1、H2、H3亚型的表达
与空白对照组（0.±0.、0.±0.、0.±0.）和假手术组（0.±0.、0.±0.、0.±0.）比较，其余各组大鼠MVN中H1、H2、H3的表达水平显著上调（P＜0.05）；与模型对照组（0.±0.、0.±0.、0.±0.）比较，天麻素高剂量组（0.±0.、0.±0.、0.±0.）大鼠MVN组胺受体H1、H2、H3的表达水平显著上调（P＜0.05）；与天麻素中（0.±0.、0.±0.、0.±0.）、低（0.±0.、0.±0.、0.±0.）剂量组比较，天麻素高剂量组MVN组胺受体H1、H2、H3的表达水平显著上调（P＜0.01），差异均有统计学意义。详见表4，图2～4。
4.3PCR法检测MVN中组胺受体H1、H2、H3mRNA表达水平
与空白对照组（1.±0.、1.±0.、1.±0.）和假手术组（0.±0.、1.±0.、1.±0.）比较，其余各组大鼠MVN中H1、H2、H3mRNA的表达水平显著上调（P＜0.05）；与模型对照组（1.±0.、1.±0.、1.±0.）比较，天麻素高剂量组（3.±0.、3.±0.、3.±0.）大鼠MVN中组胺受体H1、H2、H3mRNA的表达水平显著上调（P＜0.05）；与天麻素中（2.±0.、2.±0.、2.±0.）、低（2.±0.、2.±0.、2.±0.）剂量组比较，天麻素高剂量组MVN中组胺受体H1、H2、H3mRNA的表达水平显著上调（P＜0.01），差异均有统计学意义。详见表5。
4.4Western-Blot法检测MVN中组胺受体H1、H2、H3亚型的表达水平
与空白对照组（0.±0.、0.±0.、0.±0.）和假手术组（0.±0.、0.±0.、0.±0.）比较，其余各组大鼠MVN中H1、H2、H3的表达水平显著上调（P＜0.05）；与模型对照组（0.±0.、0.±0.、0.±0.）比较，天麻素高剂量组（0.±0.、0.±0.、0.±0.）大鼠MVN中组胺受体H1、H2、H3的表达水平显著上调（P＜0.05）；与天麻素中（0.±0.、0.±0.、0.±0.）、低（0.±0.、0.±0.、0.±0.）剂量组比较，天麻素高剂量组MVN中组胺受体H1、H2、H3的表达水平上调（P＜0.05），差异均有统计学意义。详见图5。
5讨论
前庭代偿是一种中枢过程，其中前庭内侧核的作用尤为关键[8]。前庭系统的平衡功能是通过前庭外周终末器与前庭中枢共同实现。UL后，前庭外周终末器的信号传入永久性丧失，因此前庭代偿一定发生在中枢传导通路中[9]；目前的行为学和电生理研究结果显示,损伤侧的MVN神经细胞的静息电位活性由高转低，而对侧的神经细胞活动度正常或增高[10]。双侧MVN电位的不平衡是引起眼动和姿势不对称的根本原因[11]。前庭中枢系统通过自身强大的再平衡功能，使得上述症状在短时间内逐渐缓解得到改善，这一过程即为前庭代偿，与中枢系统有关，至今机制仍未完全明确。本实验采用UL复制前庭功能障碍大鼠模型。术后大鼠空间姿势反射结果表明造模成功，麻醉苏醒后出现失平衡表现，提示UL后MVN神经元因受损的初级前庭传入神经失去兴奋性表现出低活性。
中枢系统含有大量的神经递质，而组胺作为重要的中枢神经递质，参与前庭功能的调控[12]。组胺通过与其特异性受体相结合使细胞兴奋性改变产生不同的生物学效应，其受体分为H1～H4亚型，均为G蛋白偶联受体家族[13]。报道显示，组胺H1受体大量存在于MVN，介导组胺对前庭核的突触后兴奋作用[14]，组胺H1受体在MVN中激活导致神经元的去极化和兴奋，在前庭代偿中起到促进作用[15]。组胺H2受体同H1亚型均为突触后受体，表达于外周前庭终末器及前庭核团中，与前庭神经细胞兴奋性相关[16]；组胺H3受体是一个突触前受体并且能下调组胺能末梢组胺的合成和释放[17]。
Lozada[18]表明H3受体参与突触前机制导致同侧前庭核神经元静息活动正常化，与组胺释放的负反馈调节机制相关。H3受体拮抗剂倍他司汀通过阻断突触前H3受体并诱导H3受体下调，增加组胺的周转和释放[19]。H2受体拮抗剂或H3受体激动剂阻断组胺能神经递质的传递引发了与UL后类似的平衡失调症状[20]；组胺H4受体与H3亚型受体同源性较高，倾向与Gi/o蛋白偶联，调节过敏和炎症反应，但机制尚不清楚[18,21]。因此，在前庭神经元电位维稳的既需要H1、H2受体激活后兴奋性作用，也离不开H3受体抑制性作用的存在。因此组胺H1、H2、H3受体均参与前庭代偿过程且具有调控作用。
近年来，研究发现天麻素对于治疗眩晕症有良好的疗效[22]。它具有独特的优势，与前庭镇静药不同的是，前庭镇静药用于缓解症状通常会妨碍恢复前庭功能[23]，但天麻素旨在促进中枢前庭代偿。曹丽萍[24]在天麻素治疗眩晕症临床疗效的meta分析中指出天麻素疗效显著优于目前眩晕常用药物。
本研究发现，UL诱导的前庭功能障碍大鼠MVN中组胺受体H1、H2、H3亚型均有表达，较正常大鼠显著升高，提示组胺受体H1、H2、H3亚型的过表达在前庭功能障碍发病过程中发挥了重要作用[25]。而天麻素对自发性眼震频率的有效调控也说明了其促代偿作用，并且天麻素促进H1、H2、H3受体基因及蛋白的表达，提示天麻素促代偿作用可能通过上调组胺受体表达实现，而不同剂量天麻素呈现剂量依赖关系。这些发现不仅为损伤后中枢神经回路的可塑性和功能恢复提供了新的见解，而且有望成为前庭功能障碍的一种新的潜在治疗靶点。
综上所述，天麻素上调MVN组胺受体H1、H2、H3、mRNA及蛋白表达水平可能是为今后临床防治前庭功能障碍及促进前庭代偿提供新方向。
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