Epi4K癫痫遗传学合作研究项目简介及成 [复制链接]

鉴于在后续的文章中，我们将对Epi4K的成果进行解读，而Epi4K的第一个成果即为癫痫脑病（IS/LGS）的新生突变（denovomutation，DNM）研究，故在本文中我们对DNM的性质、特点、研究历史及与疾病（特别是神经系统遗传病）的关系方面做一个简单的介绍。

一、何为新生突变？

新生突变即denovoMutation，denovo源于拉丁语，de意为“From”，novo意为“New”，故denovo意为“Fromthenew，Anew,Afresh”。新生突变是胚系突变（GermlineMutation）的特殊类型，具有遗传性，但由于突变发生于父母生殖细胞形成时（减数分裂期），故父母检测不到该突变。不过应注意区分新生突变与体细胞突变（SomaticMutation），两者均不能在患者父母中检出，但前者发生在受精卵形成前，后者发生在受精卵形成之后且不具有遗传性（体细胞突变造成的生殖细胞嵌合除外，这种情况下体细胞突变具有遗传性）。

二、新生突变率

每个人的基因组中，都存在一定数量、不同类型的新生突变。但新生突变就像一个捉摸不定的幽灵，藏匿于人群之中，然后又毫无征兆突然现身，这为早期的遗传学家对其研究造成了极大的困难。但是，年，天才的现代群体遗传学创始人之一J.B.S.Haldane抽茧剥丝，利用伦敦地区血友病流行病学数据，计算得到血友病的新生突变率大约为每代2X10-5。J.B.SHaldane的突变率计算基于以下理论基础点：

1、自然选择对血友病突变造成了淘汰

2、人群中产生的突变（新生突变）与淘汰达到平衡

3、等位基因型频率可计算，自然选择淘汰力度可计算

4、假设x为男性血友病患者在人群中的比例，f为血友病男性患者生育率，那么在总数为2N（N男+N女）的大样本人群中，每代有(1–f)xN的等位基因型遭淘汰，需要新生等量的突变基因型以达到平衡

5、故每代每人血友病突变率为(1–f)x

J.B.SHaldane对血友病的研究，是人类历史上第一次对新生突变率做出的科学推测。基于Haldane的研究，遗传学家们尝试着计算出了每代每碱基突变率：

1、Alexey.S.Kondrashov等通过对8种常染色体显性遗传病、12种X连锁遗传病的每代突变率及其致病基因新生突变分析，得到人类平均每代每碱基突变率约为1.8X10-8

2、Michael.W.Nachman等通过比较人类与猩猩之间假基因的关系，得到人类平均每代每碱基突变率约为2.5X10-8。

Kondrashov、Nachman两位学者将人的新生突变率已经计算至1-2X10-8左右，而进入基因组时代后，特别是二代测序的推广应用，使得直接在全基因组范围内检测新生突变得以实现：Donald.F.Conrad等通过对2个trios进行全基因组测序，分别发现49和35个新生突变。结合同时期研究结果，最终得到人类平均每代每碱基突变率约为1.8X10-8

三、影响新生突变率的因素

　　诸多内在因素可以影响新生突变率，如突变类型：

１、单个核苷酸替换新生突变率是其他类型突变率的25倍以上

2、新生缺失突变率是插入突变率的3倍以上

3、CpG岛可提高单个核苷酸替换新生突变率一个数量级以上

4、复杂形式的突变类型（如倒位）非常罕见

而性别特别是父亲的生育年龄，是影响新生突变率的重要因素，早在年，J.B.S.Haldane就提出男性X染色体的新生突变率，至少是女性的“十倍以上”，Haldane认为：“女性的卵原细胞绝大部分在出生时既已形成，而男性的精原细胞却伴随着男性的性生活持续复制形成精子。考虑到突变产生于细胞分裂时的错误复制，我们理应理解新生突变的发生男性多于女性（生殖细胞）”

年，AugustineKong等对72个冰岛trios完成了全基因组测序，发现

1、绝大部分的新生突变来自父亲

2、父亲生育年龄与新生突变率呈线性增加关系，每增加1岁，子代新生突变平均增加2.01个

3、平均每代每碱基突变率1.2X10-8

由父亲生育年龄增加所带来的新生突变率的增加，必然影响疾病的发生率：1、早在年，现代遗传学鼻祖WilhelmWeinberg就发现散发的软骨发育不全病人最常见于父母的最后一个孩子

2、年，Risch等发现包括Marfan综合征、早衰症在内的12种疾病的发病率与父系生育年龄有着极强的关系

而从新生突变的来源上来看，绝大部分的新生突变也源自父亲：

1、年，Wilkin等报道40例散发软骨发育不全患者新生致病突变全部来自父亲

2、年，Moloney等报道57例并指畸形患者新生致病突变全部来自父亲3、年，Carlson等报道25例多发性内分泌腺瘤综2B型综合征患者新生致病突变全部来自父亲

4、年，Glaser等报道22例Crouzon-Pfeiffer综合征患者新生致病突变全部来自父亲

新生突变会受到性别的影响，然后反过来新生突变也可影响X连锁疾病患者性别比例：

1、包括Rett综合征、Wildervanck综合征在内的13种严重的致死性、影响生育率的X连锁显性疾病罕有男性患者

2、一方面，可能由于男性是X染色体单倍体，表型更重，导致男性患者终止于妊娠期

3、另一方面，由于突变导致疾病表型严重，断绝生育，故所有患者突变来自于新生突变；而由于男性X染色体新生突变率远大于女性X染色体，新生突变绝大部分来自于精子；而精子的X染色体只会传给女儿，故罕有男性患者

但值得注意的是，上述性别、父亲生育年龄对新生突变率的影响，仅适用于点突变及插入/缺失突变，并不适用于拷贝数变异、核型异常等其他形式的新生突变，如：

1、杜氏肌营养不良的新生突变，93%的点突变来自于父亲，而87%的缺失突变来自于母亲

2、另一项研究中，多发性神经纤维瘤9/11的点突变来自于父亲，而16/21的缺失突变来自于母亲

3、21三体综合征，93%的突变来自于母亲

4、Klinefelter综合征（XXY综合征），突变来自于父亲或母亲概率相等

四、新生突变与神经系统罕见孟德尔疾病

神经系统罕见孟德尔疾病，指的是一组发病率低（1/1,~1/,）、主要累及神经系统的单基因遗传病，大部分具有先天性、终身性的特点，具有很高的致残率、致死率，治疗困难，危害极大。诸多神经系统罕见孟德尔疾疾病表型重、严重影响甚至断绝生育，致病基因的新生突变几乎是产生疾病的唯一途径。

.

由于神经系统罕见孟德尔疾病几乎不可能形成完整的大家系，传统的连锁定位-鉴定克隆策略不能用于该类疾病，致使遗传研究极为困难，少数成功案例需要一定机缘巧合，如：

1、Apert综合征是以颅缝早闭、严重并指（趾）为特征并伴有不同程度皮肤、骨骼、大脑、内脏异常的严重先天畸形

2、FGFR1、FGFR2均于年通过经典的家系定位克隆，分别鉴定为Crouzon综合征、Jackson-Weiss综合征的致病基因，两者表型均在一定程度上Apert综合征重叠，但表型轻，可形成足够大的家系用于连锁分析

3、研究人员随后对40名Apert综合征患者进行了FGFR2的突变筛查，而该40名患者均检出了FGFR2突变，从而通过候选基因克隆策略鉴定了FGFR2为Apert综合征的致病基因

但是，随着新一代测序技术的普及，以正常父母-患者trio为单位进行测序，可以极大的缩小候选致病基因范围，找到致病基因：

疾病疾病

研究及结果

Olmsted

syndrome

对一个Trio进行了外显子组测序及Sanger测序验证，发现携带TRPV3的新生突变，随后另外5名患者的也发现该基因突变

Schinzel-

Giedion

syndrome

对4名患者进行外显子组测序及Trios内的Sanger测序验证，发现均携带SETBP1的新生突变，随后另外8名患者的也发现该基因突变

Bohring--Opitz

syndrome

对3名患者进行外显子组测序及Trios内的Sanger测序验证，发现均携带SETBP1的新生突变，随后另外13名患者中的7人的也发现该基因突变

Ohdo

syndrome

对4名患者进行外显子组测序及Trios内的Sanger测序验证，发现均携带KAT6B的新生突变，随后另外9名患者也发现该基因突变

Tobecontiuned……

又如，Kabuki综合征（OMIM）的致病基因鉴定克隆过程，也是在神经系统罕见孟德尔疾病遗传研究中利用新一代测序技术的典范：

1、Kabuki综合征，是一种先天性疾病，表现为面容异常、心脏畸形、骨骼异常、免疫缺陷、轻-中度精神发育迟滞。该病极为罕见，发病率1/,，全世界报道约例，且绝大部分为散发病例，偶呈常染色体显性遗传报道。

2、年，SarahB.Ng等对收集到的10个Kabuki综合征患者进行了外显子组测序：

1、7名患者均带有MLL2基因突变，Sanger测序发现剩下3名患者中两名患者带有MLL2基因框移突变，外显子组测序未检出

2、随后SarahB.Ng等对另外43名Kabuki综合征患者用Sanger测序进行了MLL2基因的突变筛查，发现其中26名患者带有突变，故共有35/53(66%)的Kabuki综合征患者带有MLL2基因突变

3、在35名带有MLL2基因突变的患者中，12名患者为denovo突变，2名为遗传突变，余21名患者父母样本不全

又如，儿童交替性偏瘫（Alternatinghemiplegiaofchildhood,AHCOMIM））的致病基因鉴定克隆过程，也是在神经系统罕见孟德尔疾病遗传研究中利用新一代测序技术的典范：

1、儿童交替性偏瘫，一般在出生后半年内起病，表现为以短暂性发作性偏瘫发作为主，常伴有其他发作性症状，如肌张力障碍、痫性发作等，非发作性症状包括发育迟滞、不同程度的智力障碍、共济失调、手足舞蹈徐动症、锥体束症状等。该病罕见，发病率1/1,,，绝大部分为散发病例，偶呈常染色体显性遗传报道

2、年HendrikRosewich等对收集到的3个AHCtrios进行了外显子组测序，发现3名患者均带有denovo突变的基因仅有ATP1A3

3、随后HendrikRosewich等用Sanger测序对另外21名AHC患者进行了ATP1A3基因的突变筛查，发现该21名AHC患者均带有ATP1A3基因的突变，且经验证均为denovo突变

4、ATP1A3亦是快发病性肌张力障碍帕金森综合症（rapid-onsetdystonia-parkinsonism,RDP,DYT12）的致病基因

又如，遗传性感觉-自主神经病（hereditarysensoryandautonomicneuropathies，HSAN）的致病基因鉴定克隆过程，也是在神经系统罕见孟德尔疾病遗传研究中利用新一代测序技术的典范：

1、遗传性感觉-自主神经病，是一种先天性疾病，表现为痛温觉消失，患者自残、无痛骨折、伤口愈合缓慢、运动发育迟缓。该病罕见，发病率未知

2、年EnricoLeipold等对收集到的1个德国HSANtrio进行了外显子组测序：患者仅检出一个新生突变，SCN11A：c.TC(p.LeuPro)

3、随后EnricoLeipold等对另外58个HSAN患者用Sanger测序进行了SCN11A基因的突变筛查：一名瑞典患者亦检出SCN11A：c.TC(p.LeuPro)

上述研究结果表明：.

1、新生突变在神经系统罕见孟德尔疾病，特别是表型严重影响、断绝生育疾病的发生中，起到重要作用

2、以患者+父母trio为单位进行二代测序，是目前发现新生突变高效可行的策略

3、在少量神经系统罕见孟德尔疾病患者中发现某基因新生突变，再到较多其他患者中筛查该基因的突变，是行之有效的鉴定克隆神经系统罕见孟德尔疾病新致病基因的策略

五、新生突变与常见神经精神疾病

相较于罕见疾病，新生突变也极有可能在常见神经精神疾病疾病起到重要作用，其理由在于：

1、以孤独症、精神分裂症、癫痫脑病等为代表的常见神经精神疾病，表型重，肯定会对人群的生育率产生影响

2、但此类常见疾病，却在自然选择的压力下，仍以大于1%的发病率，在不同人群、不同种族、不同国家的确广泛存在

3、发病率均与父系生育年龄明显相关

4、某些常见神经精神疾病，如智力障碍、癫痫脑病，其“常见病”的表现之下，很可能是由多达数百种不同基因所导致的“罕见病”组成的

在二代测序时代到来之前，对常见神经精神疾病的新生突变研究，主要以对候选基因进行测序来完成，如：年，Piton等以个编码蛋白与神经元突触功能相关的X染色体基因为候选基因，对名孤独症患者及名精神分裂症患者进行Sanger测序，发现两名孤独症患者分别带有IL1RAPL1和MECP2基因的新生突变，前者调节神经元突触内电压门控钙离子通道，后者调节轴突生长发育。随着二代测序技术到来，以患者+父母trio为单位进行二代测序寻找新生突变，很快在常见神经精神疾病遗传研究中展开

年，Vissers等对10名不明原因精神发育迟滞患者（智力障碍）及其健康双亲进行外显子组测序并经过Sanger测序验证，发现：

1、10名患者，携带9个非同义新生突变，分别位于不同基因

2、综合从基因功能、保守性等多方面信息，共有6个突变可以作为致病突变解释疾病发生

3、结论：新生单个核苷酸突变可能是人群中精神发育迟滞（智力障碍）的主要致病因素

年，Ligt等对名IQ低于50的重度智障患者及其健康双亲进行外显子组测序并经过Sanger测序验证，发现：

1、在53名患者中发现了79个新生突变?10个新生突变，3个母系遗传X连锁基因突变位于已知智障致病基因，剩余新生突变位于24个基因可视为候选基因2、挑选功能与疾病最相关的5个基因，在另外名智障患者中进行Sanger测序，发现分别三名患者携带3个突变

3、结论：新生突变可能是智障的主要致病因素；外显子组测序是对重度智障完成分子诊断的有效技术手段

年，Epi4K对名婴儿痉挛症及名Lennox–Gastaut综合征患者及其健康双亲进行外显子组测序并经过Sanger测序验证，发现：

1、共有个新生突变，有9个基因包含两个以上新生突变，其中5个基因已报到与癫痫脑病有关

2、剩下4个基因中，经统计学分析，GABRB3、ALG13两个基因最为可能是致病基因

3、危害性大的新生突变比例在患者中增加

年，Gilissen等对50名的重度智障患者及其健康双亲进行全基因组测序并验证，发现：

1、80个新生突变位于编码区，且预测导致蛋白质失去功能的突变明显富集2、4个新生Indel、2个新生无义突变、3个错义突变，位于功能与智障相关的基因

3、8个新生CNV/SV，其中4个包含已知智障致病基因

4、结论：影响编码区的新生突变可能是智障的主要致病因素；全基因组测序可单独用于智障的分子诊断、遗传学研究

上述结果表明：

1、新生突变在常见神经精神疾病的发生中，起到重要作用

2、但是由于常见神经精神疾病的巨大遗传异质性，较小的样本量往往难以达到具有统计学意义的结果

六、关于新生突变研究的一点个人总结

新生突变研究，需要权衡3个方面的问题：

经济、影响力、风险

1、罕见单基因病（如Kabuki综合征），风险小、需要经济实力小（个位数的trioWES，个位数的家系验证），以发现致病基因为目的，但影响力相对较小

2、常见但具有一定单基因病背景的疾病（如智力障碍、孤独症、癫痫脑病），如果能收集其中的某一分类，风险相对也较小、需要经济实力也较小，以发现致病基因为目的，影响力大

3、复杂疾病（如IGE、NFE），新生突变在疾病发生中肯定起到一定作用，但具体未知，研究风险大，所需样本量大，但影响力大

可以看到，Epi4K选择的是第二条路线，在下期文章中，我们将会对Epi4K癫痫脑病（IS/LGS）新生突变研究结果，进行解读，敬请期待~~