撰文：旧岛望月亮
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亮点:
1.作者阐明了老年个体睡眠碎片化的脑神经机制和分子机制。
2.研究中使用的KCNQ选择性激活剂有望成为治疗失眠的候选药物，提升老年人的睡眠质量。
睡眠质量下降尤其是夜晚睡眠的碎片化，降低了老年人的幸福感。然而，与衰老相关的睡眠碎片化机制尚不清楚。年2月25日斯坦福大学医学院LuisdeLecea等人利用光遗传、电生理等技术揭示了老年个体睡眠碎片化的脑神经机制和分子机制，为治疗失眠提供了新的思路。其研究结果发表在名为”Hyperexcitablearousalcircuitsdrivesleepinstabilityduringaging”的文章中。
首先，作者了比较幼龄(3~5月)和老龄(18~22月)野生型小鼠在睡觉时睡眠/觉醒阶段的脑电图，发现老龄小鼠的睡眠成碎片化。具体表现为处于NREM*睡眠阶段和觉醒阶段的平均时间更短，而在两者之间转换的次数更多。外侧下丘脑(LH)中的食欲素(Hcrt)神经元在控制睡眠/觉醒中起着关键作用。利用Hcrt1抗体对上述小鼠的脑片进行染色，发现与幼龄小鼠相比，老龄小鼠的Hcrt神经元数量显著降低。接着，作者记录了幼龄和老龄Hcrt::Cre小鼠*在睡觉时的脑电图*，并利用光纤记录了GCaMP6f信号*，发现老龄小鼠碎片化的睡眠模式与Hcrt神经元兴奋性的增强有关(图1)。具体而言，在幼龄和老龄小鼠Hcrt神经元中都发现了睡眠阶段的GCaMP6f信号(GS)和觉醒阶段的GCaMP6f信号(GW)。老龄组GCaMP6f在两个时期的振幅较小(图1c和d)，说明其Hcrt神经元激活的阈值较低，这使睡眠与觉醒之间的相互转换更为容易。此外，老龄小鼠的G频率显著高于幼龄小鼠，而G频率在两者之间没有显著差异(图1c和d，右下角)。线性拟合相关分析发现，睡眠时间与G频率呈负相关(图1f)，表明睡眠时间的缩短可能是因为Hcrt神经元的过度兴奋。
*NREM：根据脑电图特征，睡眠分为非快速眼动睡眠(NREM)和快速眼动睡眠(REM)。前者包括睡眠的第一到第四阶段，后者会出现眼球快速运动并通常伴随梦境的产生。
*Hcrt::Cre小鼠：利用Cre-LoxP重组酶系统对小鼠脑内的Hcrt神经元上的基因序列进行重组或敲除。Cre重组酶能在催化DNA链交换过程中，特异性识别DNA上的LoxP位点。并与其共价结合，对LoxP位点间的基因序列进行操纵。
*脑电图和统计分析表明Hcrt::Cre小鼠模型中，老龄小鼠的睡眠仍然成碎片化(图1a、1b和1e)。
*GCaMP6f：一种钙敏感的荧光蛋白，能特异性地反映细胞内游离的钙离子浓度变化。目前常被用于表征神经元的活动状态。
图1幼龄和老龄小鼠睡眠/觉醒阶段Hcrt神经元的自发活动
接着，作者试图研究激活Hcrt神经元对小鼠睡眠模式的影响。将编码AAV-DIO-ChR2的病**注射到幼龄和老龄Hcrt::Cre小鼠的外侧下丘脑。在NREM(图2a-f)和REM阶段(图2g-l)，用一系列强度和频率不同的蓝光刺激幼龄和老龄小鼠的Hcrt神经元，并记录该过程的脑电活动。高强度和高频率的刺激能立即引起幼龄和老龄小鼠NREM/REM睡眠向觉醒的转换(图2a和g)。而在不同强度和频率的光刺激下，老龄小鼠从睡眠向觉醒转换的潜伏期更短(图2b-c、h-i)。在NREM(图2f)和REM(图2l)阶段，激活Hcrt神经元显著延长了老龄小鼠的觉醒时间。此外与老龄小鼠相比，幼龄小鼠需要更强的光刺激才能诱发相同的觉醒时间(图2d、2J)。上述结果进一步证实了老龄小鼠睡眠/觉醒的相互转化与Hcrt神经元过度兴奋之间的关系。
*AAV-DIO-ChR2：该病*能使Hcrt神经元受蓝光刺激而激活。AAV即腺相关病*载体，能感染神经细胞并沿着神经环路传播。DIO是与Cre配合来控制目的基因(ChR2)表达的元件。在Cre存在的情况下，对原有基因进行敲除，并插入病*携带的基因序列。ChR2是一类光敏感通道蛋白。它能在蓝光刺激下使阳离子通道开放，产生内向电流，进而激活神经元。
图2光遗传刺激Hcrt
为了探究Hcrt神经元的兴奋性是否受年龄的影响，作者用全细胞膜片钳记录了幼龄和老龄Hcrt::Cre小鼠脑片的Hcrt神经元的自发神经活动。结果发现老龄小鼠Hcrt神经元自发放电比例高于幼龄小鼠(图3a)。并且在相同的输入电阻下，老龄组Hcrt神经元的静息膜电位(RMP)的去极化水平更高(图3c和3d)。由于两组神经元的阈值没有显著性差异，因此在老龄组Hcrt神经元中RMP与阈值之间的差异更小(图3e和3f)。即更小的去极化就能使老龄组Hcrt神经元激发到动作电位(AP)，表现为该神经元的AP振幅更高(图3b和3g)。而AP的其它特性在两组间之间没有差异(图3h-k)。
作者推测两组小鼠神经元兴奋性的差异是由电压门控钾离子通道(KCNQ)*介导K+电流引起的。为了验证这一想法，作者对幼龄和老龄小鼠脑片中的Hcrt神经元使用KCNQ2/3的选择性调节剂。灌流KCNQ2/3选择性阻断剂XE显著增加了幼龄组Hcrt神经元的RMP极化水平并提高了放电频率(图3l-n)。相反，KCNQ2/3选择性激活剂flupirtin使老龄组Hcrt神经元的RMP超极化并降低了放电频率(图3o-q)。单核RNA测序结果表明两组KCNQ的表达水平没有显著差异，但老龄组Hcrt神经元表达KCNQ2、KCNQ3mRNAs的比例更低，这可能是老龄组小鼠Hcrt神经元过度兴奋的原因之一。
*哺乳动物体内有五种亚型的KCNQ，分别是KCNQ1-KCNQ5。其中KCNQ2与KCNQ3能配对形成KCNQ2/3异构体，在调节神经元阈下兴奋性、复极化和突触间信号输入的敏感性方面发挥重要作用。
图3老龄小鼠Hcrt神经元的兴奋性增强与电压门控离子通道
鉴于KCNQ通道在大脑中的广泛表达，作者试图探讨Hcrt神经元中该通道对睡眠模式的影响。将不同胎次的Hcrt::Cre幼龄小鼠随机分为两组，其中一组利用CRISPR/SaCas9*特异性敲除小鼠Hcrt神经元中的KCNQ2/3基因，另一组注射仅带有mCherry*的病*载体作为对照(图4a)。比较两组小鼠睡眠/觉醒阶段的脑电图，发现敲除Hcrt神经元中KCNQ2/3基因使幼龄小鼠在NREM阶段出现睡眠碎片化(图4b)。然后对mCherry标记的Hcrt神经元(图4c)进行全细胞记录，发现敲除KCNQ2/3基因的Hcrt神经元表现为RMP的去极化水平和自发放电活动增加(图4d和4e)。上述结果表明特异性敲除Hcrt神经元的KCNQ2/3基因，使幼龄小鼠表现出与老龄小鼠相似的睡眠模式。
*CRISPR/Cas9是一种对目的基因进行编辑的技术。CRISPR是细菌和古细菌为应对病*入侵演化而来的免疫防御机制。它通过合成一个与特定DNA互补的gRNA，将CRISPRcas9蛋白靶向到目标位点。并切割DNA双链提高该位点的重组效率，从而利用细胞的同源重组机制进行基因组编辑。而CRISPR/SaCas9属于上述基因编辑技术的一种，可以用于敲除小鼠的目标基因。
*mCherry：一种红色荧光蛋白，常被用于标记某些细胞和分子。
图4Hcrt神经元中KCNQ2/3通道对睡眠模式的影响
为了进一步验证KCNQ2/3通道在睡眠调节中的作用，作者研究了KCNQ2/3配体在体内的药理作用。结果表明，与对照组(生理盐水)相比，注射XE显著增加了幼龄野生型小鼠的觉醒次数(图5a)。此外，与对照组(二甲基亚砜)相比，flupirtine显著增加了老龄野生型小鼠NREM的数量和稳定性(图5b)。由于睡眠质量与认知功能相关，在物体识别任务中给予老龄小鼠flupirtine促进了其对新物体的探索(图5c-e)。除此之外，幼龄时期病理性缺失Hcrt神经元会导致I型嗜睡症。该疾病表现为白天过度嗜睡，突然失去肌张力，并且脑电图上出现类似REM阶段的脑电波。尽管健康的老龄小鼠和患有嗜睡症的幼龄小鼠都表现出睡眠碎片化，但研究发现二者潜在的机制并不相同。
图6KCNQ2/3配体在体内的药理作用
该文章揭示了过度兴奋的Hcrt神经元会导致睡眠碎片化。首先，老龄小鼠Hcrt神经元的神经兴奋性增强，且光遗传激活后觉醒时间延长。接着，研究发现老龄小鼠Hcrt神经元表现出的高度兴奋性与KCNQ2/3表达降低有关。特异性敲除幼龄小鼠Hcrt神经元中的KCNQ2/3基因破坏了睡眠的稳定性。而KCNQ选择性激活剂flupirtin使Hcrt神经元超极化，从而促进了老龄小鼠的睡眠。此外有研究表明，与对照组相比，阿尔茨海默症患者的Hcrt神经元数量显著降低。作者推测阿尔兹海默症可能会加剧老龄患者的睡眠片段化。