人类多能干细胞(hPSCs)是一种能够分化成为任何一种具有自我更新能力的细胞类型，在研究和治疗方面都有巨大的潜力。当打算将这些细胞在治疗环境中使用这些细胞时，需要一种能量化的具有一致性的良好生产规范(GMP)标准。
由JisunKim博士和哈佛医学院的团队领导的一项新研究发表在《Natureprotocols》杂志上，提出了一种新的方案，可以在一个“点（spot）”中(一个小的、封闭的区域)而不是传统的二维单层膜中培养和分化hPSCs1。该持续28天的实验方法可以产生丰富的中脑多巴胺祖细胞(mDAPs)和中脑多巴胺神经元(mDANs)，是研究和治疗的理想选择。
该方案已经在帕金森氏症(PD)的研究中取得了成功，该疾病的病理特征之一是黑质致密部中脑多巴胺能(mDA)细胞的丢失，这使得细胞替代疗法具有诱人的前景。
最近，研究人员在帕金森病的临床前小鼠模型中使用了这种“spotting”的方法，移植了mDAPs的研究样本恢复了运动功能2。更令人兴奋的是，该方案首次应用于不需要免疫抑制剂的散发性PD患者的自体细胞替代治疗;祖细胞植入18-24个月后，患者PD症状稳定或改善3。
将hPSCs分化成mDA
在一个6cm的培养皿上，将1×的hPSCs在6个10μl的spot上培养。在28天内，细胞经历了三个阶段分别是:floorplate(FP)、neuralprogenitor(NP)和mDAP/mDAN阶段。FP和NP阶段后，细胞在第15天进行单层培养，以避免细胞过度堆积，并允许继续分化。FP和NP阶段包括添加信号化学物质的组合，如LDN、FGF8和CHIR，而BDNF和GDNF等神经营养因子则在最后的mDAP/mDAN阶段添加。
图1.SchematicoverviewofthespottingmethodformDAdifferentiationfromhPSCs.a.hPSCs向mDA分化过程中spot周围的物理和化学环境。b.受时间控制的mDA分化阶段总结。分化过程包括FP诱导、NP诱导和mDAP/mDAN诱导阶段。第15天进行细胞再生以避免细胞浓度过高。根据不同的应用，mDAPs可以被冻结用于移植。
与传统方法相比，spotting的方法明显减少了培养基的酸化。且能够更有效地生成mDA细胞，即时是在不良的培养条件下，此方法导致的细胞脱落相关的细胞损失要少得多(图3)。值得注意的是，由于严重的细胞损失，几乎90%的传统2D单层法的尝试在第28天都无法提供有意义的数据，而spotting法大多成功，且其产生的mDA细胞比传统的二维单层培养法更健康(图2b)。
图2.MorphologicalchangesincellsduringtheprocessofdifferentiationofmDAfromhPSCs.
a.不同分化天数下(1-28天)的明视野镜检结果。右图显示了细胞培养的示意图。培养第10天，单层培养的培养液pH显著低于spotting培养的细胞(pH5.9vs7.9)。红色箭头表示细胞具有三角形的形态，表示具有非神经元异质表型的未分化细胞群。白色箭头表示具有神经元形态的细胞。Scalebars,μm。b.Spotting和单层培养方法到第28天时的培养成功率(来自4个不同的研究人员的30次不同的实验)。Spotting法显示了H9hESC和C4hiPSC的成功率均高于单层培养法。
图3.Cells’survivalandyieldduringthemDAdifferentiationprocess: