使用皮层神经元标记物来靶向耳蜗背核中的细胞
ThawannMalfatti，BarbaraCiralli，MarkusM.Hilscher，StevenJ.Edwards，KlasKullander，RichardsonN.Leao和KatarinaE.Leao
巴西纳塔尔北里奥格兰德联邦大学大脑研究所听觉和神经元活动实验室
瑞典乌普萨拉乌普萨拉大学神经科学系发展遗传学奥地利分部维也纳维也纳理工大学分析和科学计算研究所
*katarina.leao
neuro.ufrn.br摘要
耳蜗背核(DCN)是第一个整合体感和听觉输入的听觉区域。该区域对听觉研究特别感兴趣，因为躯体耳鸣发病率高，其他形式耳鸣的异常活动增加。然而，缺乏用于体内操作的有用遗传标记阻碍了DCN对耳鸣病理生理学贡献的阐明。在这项工作中，我们评估了含有钙/钙调素依赖性蛋白激酶2α(Camkiiα)启动子的腺相关病*载体(AAV)和我们的小鼠烟碱乙酰胆碱受体α2亚单位系(Chrna2)-Cre是否可用于靶向特定的DCN人群。CaMKIIα启动子通常用于neo和古皮层主要神经元的研究，而Chrna2-cre小鼠在抑制中间神经元的皮层树突中表达cre重组酶。我们发现CaMKIIα不能用于特异性靶向兴奋性梭形DCN神经元。由CaMKIIα启动子驱动的EYFP表达在梭形层中更强，但标记细胞显示出不同的形态，表明它们属于不同类别的DCN神经元。由CaMKIIα启动子驱动通道视紫红质2(ChR2)后的光刺激在一些单位产生尖峰，但是当光刺激与声音呈现一致时，放电速率降低。在DCN，eArch3.0(CaMKIIα驱动)的表达和激活在某些单位产生了尖峰抑制，但最重要的是，伴随的光刺激延迟了声音驱动的尖峰。我们通过水凝胶包埋技术(CLARITY)探索了在Chrna2-Cre小鼠的DCN中Cre+细胞的存在。DCN几乎没有Cre+细胞体；然而，我们观察到大量的投射来自耳蜗腹侧核(VCN)。VCN注射的顺行标记Cre依赖性AAV揭示了两个主要的投射:一个出现在梯形体的同侧上橄榄核和对侧内侧核(浓密的细胞)，第二个束终止于DCN，表明后者是兴奋性ChrNa2+T-星状细胞。刺激VCNChrna2+细胞的ChR2表达末端(DCN上施加的光)增加了声音反应和无反应的DCN单位的放电。这项工作表明，在皮质研究中密集使用的分子工具可能有助于操纵DCN，特别是在耳鸣
研究。
关键词:听觉系统，通道视紫红质，古二氢视紫红质，单位，耳蜗背核，耳蜗腹核，CaMKIIα，Chrna2
1导言
听觉脑干的耳蜗背核(DCN)是听觉和多感觉信号的第一个整合者，并被认为是耳鸣生理病理学的关键结构(Kaltenbach等人，；Tzounopoulos，年；Baizer等人，年)。DCN的细胞接收直接或间接(例如由耳蜗腹侧核-VCN中继)的声音输入到分层排列的不同细胞群。细胞密度最大的DCN场是由兴奋性梭形细胞插入中间神经元形成的梭形细胞层。DCN的一个有趣的方面是它与小脑的结构相似(Devor，)，小脑被认为负责整合处理(例如声音/体感，Oertel和Young，)。
由于颞下颌耳鸣的流行，DCN的异常感觉统合在临床上是相关的(Levine，；Grossan和Peterson，)。其他形式的机械性耳鸣也归因于的异常活动(韩等人，年)。此外，大量研究表明，DCN回路中与噪声引起的耳鸣相关的突触和固有细胞特性发生了改变(肖尔等人，年综述)，但迄今为止耳鸣治疗并未专门针对该区域。耳蜗腹侧核(VCN)也可导致噪声性耳鸣(Kraus等人，；Coomber等人，年)。当耳蜗核神经元将听觉信号传递到听觉通路的更高区域时，任何耳蜗核亚区域中的异常活动都会触发上游变化(Kraus等人，；Coomber等人，年)。来自听觉皮层和下丘的异常活动也会在DCN产生下游变化，因为其细胞通过下行听觉纤维接收反馈(Winer和彼尔托，；Milinkeviciute等人，年)。尽管其在生理学上的重要性和在耳鸣中的公认作用，特定DCN人群对听力和耳鸣病理生理学的贡献在很大程度上是未知的。
由于其细胞类型和小脑样结构的多样性，DCN电路研究可以受益于识别关键的神经元标志物(希尔舍尔等人，年)。钙/钙调素依赖性蛋白激酶2α(Camkiiα)启动子广泛用于靶向皮质锥体细胞。来自大鼠的免疫组织化学数据显示CaMKIIα在DCN分子和梭形细胞层中表达(Ochiishi等人，)。在小鼠中，CamKiαRNA广泛分布于梭形层(Lein等人，年)。因此，通过CaMKIIα启动子表达报道蛋白或光遗传蛋白的病*载体可以应用于DCN操作。皮层中间神经元标记也可以用来标记DCN细胞。钙缓冲蛋白小清蛋白(PV)在海马/新皮质研究中用于靶向快速尖峰中间神经元(Kawaguchi和Kondo，；Courtin等人，年)和抑制性神经元特有的PV表达也在一些皮层下核中有所描述(乌纳尔等人，年)。在DCN，PV跨层分布，没有种群特异性。此外，生长抑素的表达(在以皮质/海马中间神经元为靶点的树突中发现)似乎不遵循层/细胞特异性表达(Lein等人，)，类似于皮质/海马，其中PV和生长抑素的表达可能相当混杂(Kawaguchi和Kondo，；Mikulovic等人，年)。最近，烟碱乙酰胆碱受体α2亚单位(chrna2)被描述为高特异性中间神经元群(CA1)的标记
腹侧海马区的oriens-腔隙性分子细胞LM或新皮质区的L5Martinotti细胞；Le?ao等人，年；Hilscher等人，年)。开发并评估了一种Chrna2-cre小鼠品系，该品系极大地推动了树突靶向中间神经元群体的研究(Le?ao等人，；金恩等人，年；Hilscher等人，年)。Chrna2-cre小鼠的Cre+细胞似乎属于几个皮层下核的单一群体(Siwani等人，年)。Chrna2在DCN的表达未被描述，但全脑成像(清晰)显示DCN几乎没有细胞体表达，其附近有Cre+细胞群，并且Chrna2+阳性轴突终末大量靶向DCN(Mikulovic等人，；Siwani等人，年)。
在这里，我们测试带有CaMKIIα启动子的腺相关病*载体(AAV)是否可用于体内操纵DCN回路。AAV编码的光遗传蛋白表达和与短暂声音呈现配对的光刺激用于功能性识别细胞和评估与短暂声音刺激组合的CamKiα+神经元的输入/输出功能中的光学去极化/超极化效应。最后，我们研究了Chrna2+细胞的活化
支配DCN的神经调节梭形细胞的功能。
2结果
2.1听觉脑干反应在光遗传兴奋期间是正常的-
CaMKIIα-ChR2阳性DCN神经元的定位
我们首先测试了Ca2+/钙调素激酶2α(CaMKIIα)启动子是否可以用来控制DCN神经元的亚群。我们将病*载体(rAAV5/CamK2-hChR(HR)-eYFP或对照rAAV5/CaMKIIa-eYFP)注射到DCN，用于在1-2月龄C57Bl/6J小鼠的CaMKIIα启动子的控制下表达ChR2和/或增强型*色荧光蛋白(eYFP)。四周后，检测DCN的局部蛋白表达，显示注射部位附近有强eYFP信号，并向DCN的表层和深层传播，包括对照和ChR2载体(图1A，中间和右侧)。对于ChR2和对照构建体，eYFP显示DCN神经元的胞体和神经突起的强膜表达，特别是在胞体垂直于DCN边缘伸长的细胞中，厚的基底树突向分子层扩散(可能是梭形细胞，图1B，箭头)。较小的神经元胞体在梭形和更深的层中也用eYFP标记，以及DCN深层的几个大神经元胞体，树突沿着DCN的内部边缘延伸(可能是巨细胞，图1C，箭头)。这表明CaMKIIα启动子对DCN兴奋性神经元并不特异，尽管它似乎确实标记了兴奋性梭形样细胞
和具有强膜表达的巨细胞。
2.2camkiiα-chr2阳性DCN神经元的光生兴奋为
伴随声音刺激而减少
接下来，我们想用CaMKIIα来研究DCN单位对光遗传调制的反应
DCN通道视紫红质2表达的启动子。之前注射过Camkiaα的小鼠
将ChR2麻醉并安装到立体定位框架上，将16通道硅胶电极垂直放入DCN(图2A)。共确定了个独立单元，其中
电压[毫伏]
平均听觉脑干反应迹线
0
25
50
电压[毫伏]
振幅
2
4
6
8
10
延迟[毫秒]
延迟
时间[毫秒]
12
6
0
6
电压[毫伏]
ABR峰值
0
25
50
电压[毫伏]
ABR峰值
2
4
6
8
10
延迟[毫秒]
公元前
D
E
Camkia-EyFPCamkia-ChR2Camkia-ChR2
图1:DCN的camkiaα-chr2-EyFP阳性神经元和注射动物的正常听觉脑干反应。a)冠状脑干切片图像，DAPI核染色后突出显示DCN和VCN(左)，对照Camkiaα-EyFP(中)和Camkiaα-ChR2-EyFP表达(右)。b)高倍共聚焦图像显示几个细长的水平体细胞(白色箭头，可能是梭形细胞)，标记有eYFP的膜表达。另一个高倍放大的例子是DCN的CaMKIIα-ChR2-eYFP标记。两个可能的巨细胞在深层(白箭头)。对于所有图像来说，外侧是左的，腹侧是下的。响应声音(D)和声音+光(E)刺激协议，使用降低到DCN的电极记录的听性脑干反应波形。左侧，平均值(黑线)和扫描电镜(红色阴影)ABR痕迹(n=13)，检测到的峰标有黑色星号。中心，前5个ABR峰值的组振幅。对，前5个ABR峰的组潜伏期。
例因对声音和光刺激均无反应而被排除在外(补充表S2)。在剩余的76个单位(n=8只小鼠)中，71%(54/76)对声音刺激(3ms，80dB，10Hz时出现5∨15kHz噪声脉冲)有反应，对声音的反应被量化并通过刺激周时间直方图(PSTHs)可视化；图2B和E)。蓝光刺激(毫米，10毫秒持续时间，10Hz，光纤尖端强度5mW/毫米)由玻璃光纤传输至DCN(米，从对侧以45°角插入；图2A)，在蓝光刺激后立即引发单位的增加发射(图2C和E)。我们发现25%(19/76)的单位对光刺激有反应。
4/26
16
通道
1.0
0.5
0.0
0.5伏[毫伏]试验
0
平均值#峰值1e
1
89
通道
次试验
0
平均值#峰值1e
0
11e
时间[毫秒]
16
通道
年审判
时间[毫秒]
0
平均值#峰值1e
时间[毫秒]
0
21e
BS
0.00
0.05
0.10
均值#PSTHspks
提单
0.00
0.15
0.30*
BS+L
0.00
0.04
0.08****
SS+L
0.00
0.05
0.10
A
B
C
D
英、法
探针光学
纤维ML
FL
DL
DCN
VCN
CaMKIIα-ChR2-eYFPDiI
卡姆基α-ChR2-eYFPDAPI
图2:在声音刺激过程中激活DCN表达CaMKIIα-ChR2-eYFP的神经元可以减少单位放电。a)左侧，记录装置中的小鼠照片，以及DAPI标记部分中蓝光刺激的记录电极和光纤的示意图，显示了DCN亚区(M1-分子层、FL-纺锤形细胞层、DL-深层)。中心，共焦图像显示了在DCN背侧区域的eYFP表达的例子，探针束用DiI染色。比例尺:米。右侧，DCN神经元沿体膜和近端树突表达eYFP的例子。比例尺:20米(B)单位的例子，其波形以更高的放大率显示(中心)，通过短暂(?20毫秒)增加其发射来响应声音刺激。C)对声音刺激没有反应但对蓝光刺激有反应而增加发射的单位的例子。d)对声音(中央)和蓝光(右侧)刺激做出响应的单元示例。e)所有单元的组平均峰值数(n=76)在声音后与基线相比有显著增加(B；左)或蓝光(L；中枢)刺激(p=2.6e-5和0.)和伴随的声音和光刺激(S+L；右；p=4.2e-5)。f)声音刺激后所有单位的组平均尖峰数(n=76)显著高于伴随的声音和光刺激后的组平均尖峰数(p=3.8e-4)。
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