《自然》最新研究：let-7家族与神经母细胞瘤
导语医院、医院等机构的研究人员证实，在神经母细胞瘤中多种机制破坏了let-7microRNA家族。这一重要的研究发现发布在7月6日的《自然》（Nature）杂志上。
《自然》报道摘要
《Multiplemechanismsdisruptthelet-7microRNAfamilyinneuroblastoma》.Nature.Jul6.doi:10./nature.
神经母细胞瘤的预后与MYCN基因扩增相关。MYCN基因本身是let-7的一个靶标，let-7作为miRNA的抑癌基因家族在许多癌症中发挥作用。LIN28B是let-7的生物合成抑制剂，它在神经母细胞瘤中过表达并调控MYCN基因。MYCN扩增的疾病中，MYCN信使RNA的水平是非常高的，足以充当let-7miRNA海绵（miRNAsponge）。然而，MYCN的竞争性内源RNA(ceRNA)功能也导致了LIN28B在MYCN扩增细胞系中可有可无，表明LIN28B有可能发挥了冗余的let-7抑制功能。此外，还发现在神经母细胞瘤中let-7遗传丢失非常常见，这与MYCN扩增呈负相关，与不良结局独立相关，为神经母细胞瘤中的染色体丧失模式提供了一个理由。由此，研究人员提出在神经母细胞瘤中通过LIN28B活性、MYCN海绵般吸收或遗传丢失几种不同的机制破坏了let-7。这一模型对于认识神经胶质母细胞瘤的发病机制、疾病建模及合理地设计治疗策略具有重要的意义，有可能代表了人类癌症一种更普遍的特征。
let-7简介
BüssingI,SlackFJ,Gro?hansH.let-7microRNAsindevelopment,stemcellsandcancer[J].Trendsinmolecularmedicine,,14(9):-.
let-7最早在秀丽隐杆线虫中发现，它是线虫时序性发育的关键性调控因子，通过沉默维持干细胞样特征的相关基因而诱导细胞分化，促进线虫从幼虫到成虫的转变。
RoushS,SlackFJ.《Thelet-7familyofmicroRNAs》.Trendsincellbiology,,18(10):-.
let-7是miRNAs中最丰富一类。人lec-7miRNA家族共有13位成员，分别为let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7e、let-7d、1et-7e、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i、miR-和miR-98，该家族所有成员的5’端具有高度保守的核苷酸序列，即“TGAGGTA”，称为“种子序列”，这些成员分别位于9个不同的染色体上。
癌症发生、进展和侵入是与癌症干细胞启动有关。癌症干细胞的启动与上皮细胞向间充质的转化(EMT)、炎性微环境及细胞周期调控紊乱等紧密相关，它们在癌症的发生中起到了重要的作用，而这些因素与let-7家族异常表达有关。let-7有许多靶基因包括RAS、MYC、HMGA2、CyclinD、DICER和CDC25等等，它们与1et-7相互作用参与细胞的生命过程，还有肿瘤的发生和发展。
LIN28的基本结构和功能
ThorntonJE,GregoryRI.《HowdoesLin28let-7controldevelopmentanddisease?》.Trendsincellbiology,,22(9):-.
LIN28家族包含两个成员,即LIN28A和LIN28B,是一类小于30kDa的蛋白。LIN28蛋白结构中包含一个冷休克结构域和一对CCHC锌指模体,在RNA结合过程中发挥功能,其中LIN28B结构域中还包含核定位信号和核仁定位信号,提示LIN28B定位在核内。LIN28主要通过对靶miRNAs的表达抑制而发挥重要功能。研究发现,LIN28蛋白主要在胞浆中诱导let-7前体(pre-let-7)3′端的尿苷化,而尿苷化的let-7前体(up-let-7)不能被Dicer酶加工,因而阻遏let-7的成熟。
ViswanathanSR,PowersJT,EinhornW,etal.《Lin28promotestransformationandisassociatedwithadvancedhumanmalignancies》.Naturegenetics,,41(7):-.
LIN28参与肿瘤的形成过程,Viswanathan等指出,在约15%的恶性肿瘤中存在着LIN28的激活。研究表明,LIN28的高表达与肿瘤的恶性程度和病人的不良预后密切相关。
LIN28/let-7通路在相关恶性肿瘤中的作用
JiJ,WangXW.《AYin-Yangbalancingactofthelin28/let-7linkintumorigenesis》.Journalofhepatology,,53(5):-.
作用LIN28与let-7之间是一种负反馈调节机制,LIN28抑制let-7的成熟过程,而LIN28也是let-7的下游靶基因,let-7通过与LIN28mRNA的3′-非编码端(3′-UTR)结合而阻遏其翻译。与LIN28/let-7信号通路相关的影响因子包括原癌基因(C-myc)、癌基因(ras)、高迁移率族蛋白(HMGA2)、RE1沉默转录因子(REST)和细胞核因子kb蛋白(NF-κB)等。有学者指出,LIN28/let-7通路在肿瘤形成过程中保持着一种阴阳平衡的状态。
LIN28/let-7/MYCN轴在神经母细胞瘤中的作用
MolenaarJJ,Domingo-FernándezR,EbusME,etal.LIN28BinducesneuroblastomaandenhancesMYCNlevelsvialet-7suppression[J].Naturegenetics,,44(11):-.
年《NatureGenetics》报道，LIN28B通过调控let-7家族调控发育进展。他们在动物水平验证了LIN2B的作用，发现LIN2B基因组异常在高危神经母细胞瘤中广泛高表达，Lin28B的高表达与神经母细胞瘤的恶性程度及预后相关。LIN28B通过抑制let-7引起了MYCN蛋白的上调。LIN28B–let-7–MYCN信号通路阻断了正常神经母细胞和神经母细胞瘤的分化。对于该信号通路的干预具有很好治疗前景。
在神经母细胞瘤中多种机制破坏了let-7microRNA家族
在神经母细胞瘤中具有十分完整LIN28B/let-7/MYCN轴（axis）。let-7通过调控MYCN3UTR来调控MYCN表达；突变MYCN中let-7a结合位点明显增强了MYCN表达。LIN28B作为let-7抑制剂，当LIN28B高表达时候明显增强MYCN的表达。let-7a与MYCN在蛋白水平负相关十分明显。
在MYCN扩增细胞中LIN28B是可有可无的。以前有报道LIN28B/let-7/MYCN调控环路发现用慢病*shRNA干扰LIN28B时候可以明显抑制MYCN蛋白表达以及细胞的生长，本文作者重复了前人的实验，在LINN28BshRNAg干扰后并没没有发现let-7水平的去抑制，而且通过过表达shRNA抗性LIN2B的回复实验并没有能够营救表型。由此作者认为以前报道的shRNA干扰效应是由于发夹*性效应造成的。（前人的实验要想推翻，要用实验验证和推理来证实）。得到了这个推论后，作者用更为缜密的实验验证作者观点。首先，用siRNA来干扰LIN28B而不是发夹结构的shRNA，选用了5个靶点，4个靶点能够抑制LIN2B同时可能去抑制let-7比表达水平，但是MYCN表达水平却并没有受到影响。然后，由于siRNA效果只能部分抑制LIN28效果，为了更为夯实的证据，可以用CRISPR/cas9技术用4个gRNA来干扰LIN28B，发现LIN28B明显降低，但是MYCN蛋白表达没有变化，并且并没有影响细胞增长，与siRNA效果一致。由此看来，let-7家族能够被活跃的去抑制的结果与前人报道相符以外，LIN28B的降低或者缺失对于MYCN扩增的神经母细胞瘤来说是没有明显影响。
扩增的MYCNmRNA是let-7的“miRNA海绵”。从目前MYCN和let-7表达关系来看，作者推理满足ceRNA模型。利用MYCN扩增细胞系(BE(2)CandKelly)和MYCN非扩增细胞系(SH-SY5Y)进行RNA-seq。发现let-7靶标池中中MYCN，HMGA2,CCND1等基因满足ceRNA模型规律。并且用荧光素酶实验做了再次验证。而且作者不但外源性进行验证，还对内源性的let-7靶标进行验证，都符合ceRNA模型规律。
在神经母细胞瘤中let-7频繁染色体缺失。作者采用比较基因组杂交（aCGH：array-basedComparativeGenomicHybridization）是通过在一张芯片上用标记不同荧光素的样品（病例样品和对照样品）进行共杂交可检测样本基因组相对于对照基因组的DNA拷贝数变化（CNV），常用于肿瘤或遗传性疾病全基因组CNV检测，直观地表现出肿瘤及遗传性疾病基因组DNA在整个染色体组的缺失或扩增。对肿瘤而言缺失片段可能包含抑癌基因，而扩增片段则可能存在致癌基因。运用aCGH发现let-7a2和let-7g缺失。
假定模型：扩增MYCN会扣留成熟的let-7分子，在MYCN扩增疾病中预计选择性压力引起let-7丢失会被减轻。在非MYCN扩增的神经母细胞瘤中，let-7的丢失、LIN28B以及let-7和MYCN负相关性在神经母细胞瘤的发病以及预后等起着关键性作用；然而在MYCN扩增性的神经母细胞瘤中，MYCN作为let-7的miRNA海绵抑制let-7在疾病中的机制显得更为重要，并且MYCN的扩增与let-7丢失在疾病作用有协同叠加效应。
let-7家族与神经母细胞瘤模型不断演化与成熟
在神经母细胞瘤中多种机制破坏了let-7microRNA家族。
a）染色体中let-7的丢失，抑制了pri-let-7转录和表达；
b）LIN28B抑制剂Drosha，抑制了pri-let-7进一步Drosha剪切成pre-let-7；
c）LIN2B抑制DICER，从而抑制pre-let-7进一步DICER剪切成maturelet-7;
d）扩增的MYCmRNA作为ceRNA抑制成熟let-7
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