运动神经元病与TDP-43蛋白的病理性表达
作者：朱明伟刘佳王鲁宁桂秋萍
文章来源：中华内科杂志,,54(01)
摘要1目的
认识TDP-43蛋白在运动神经元病中枢神经系统的病理性表达特征。
2方法
对4例经尸检病理证实的运动神经元病的临床及病理组织学特征进行总结；并对其脑和脊髓切片进行泛素、磷酸化TDP-43免疫组化染色，观察其阳性表达情况，并与同年龄、无神经疾病病史的3例病例的脑和脊髓组织进行对照。
3结果
4例病例具有运动神经元病典型的临床与组织学特征，其脑和脊髓组织中，3例存在神经元泛素阳性包涵体结构，主要表现为丝团样包涵体，致密圆形包涵体及路易样包涵体；2例存在明确的TDP-43阳性表达，表现为广泛分布于大脑运动皮层及脊髓前角的各种形态的神经元胞浆包涵体及胶质细胞包涵体，1例存在脊髓前角神经元TDP-43弱阳性表达。对照病例无泛素阳性及TDP-43阳性包涵体发现。
4结论
运动神经元病患者的中枢神经系统存在广泛TDP-43蛋白阳性表达，且其阳性包涵体具有一定特征性，值得进一步研究其形成机制。
运动神经元病是一组由上、下运动神经元变性而导致的一种难治性、进行性神经变性疾病。文献报告大约5%～10%的病例存在家族遗传性，其病因与特定的基因突变有关，但大部分散发型运动神经元病的病因及发病机制尚不清楚[1,2]。泛素(ubiquitin)曾被认为是运动神经元变性的重要标志性蛋白[3]，但这种蛋白阳性表达也见于多种其他神经变性疾病如帕金森病、多系统萎缩等的神经元和胶质细胞特异性包涵体中，因此其缺乏疾病特异性。
近年来肌萎缩侧索硬化症(ALS)的TDP-43蛋白表达被认为具有较高的特异性[4,5,6,7]。该蛋白可能成为解开散发型运动神经元病病理机制的一把钥匙[4,5,6,7]。国内开展散发型运动神经元病的临床及电生理研究已较为深入[8]，近来也有运动神经元病TDP-43分子遗传学筛查的研究报道[9]，但有关运动神经元病的尸检病例脑和脊髓蛋白质病理的研究报道很少[10]，尚无TDP-43蛋白病理表达特征的研究报道。为此，本研究观察了我院尸检病例脑和脊髓组织的TDP-43病理表达情况，以期为研究运动神经元病发病机制提供新的证据。
对象与方法1研究对象4例运动神经元病医院年至年有详细临床病历及相关实验室检查资料的病例，曾长期住院，死后获得亲属同意及签署尸检同意书，进行了包括骨骼肌在内的全身尸检。
2研究方法对4例尸检病例的常规组织学切片进行观察，包括额叶上回、中央前回、顶叶、颞叶、枕叶纹状皮质，扣带回、海马、基底节、丘脑，中脑上丘层面，桥脑蓝斑层面，延髓(舌下神经核)层面，脊髓颈6、胸7、腰4段水平，脊髓前、后神经根，舌肌、膈肌、股四头肌、三角肌的HE、LFB、Hozler等常规染色。
对上述病例库存的中央前回运动皮层、海马、颞叶及延髓舌下神经核水平，脊髓颈6、胸7、腰4段水平石蜡组织切片，使用Anti-ubiquitin(Dako公司)兔抗人多克隆抗体和Anti-phospho-TDP-43抗体(Ser/Ser,rat,clone1D3，Millipore公司)进行免疫组化染色。采用EnVision二步法(ChemMate?EnVision?试剂盒，Dako公司)，DAB显色。以相同年龄、无神经疾病病史、常规组织病理检查无异常发现的3例病例的脑和脊髓组织作为对照。
3统计学处理采用描述性方法进行统计学分析。
结果1运动神经元病4例患者的一般临床特征见表1。
2运动神经元病4例患者的组织病理学特征(表2)4例患者的脑和脊髓组织学基本特征(图1)包括骨骼肌病理所见均符合运动神经元病的诊断标准，例3、例4脊髓前角神经元见特征性的Bunina小体(图2)。
图1-
例3颈髓(C6)皮质脊髓前、侧索髓鞘变性(大体观) 监牢蓝髓鞘染色(LFB)
图2-
例3颈髓(C6)神经元变性，胞质内见Bunina小体 HE×
图3-
例1颈髓前角神经元丝团样包涵体 泛素免疫组化 ×
图4-
例2腰髓前角神经元圆形致密包涵体 泛素免疫组化 ×
图5-
例1颈髓前角神经元TDP-43卵圆形包涵体 磷酸化TDP-43免疫组化 ×
图6-
例1颈髓前角神经元及胶质细胞TDP-43阳性包涵体磷酸化TDP-43免疫组化 ×
图7-
例1运动皮质小型神经元及少突胶质细胞TDP-43阳性包涵体 磷酸化TDP-43免疫组化 ×
图8-
例2颈髓前角神经元胞质TDP-43阳性弥散型丝团样包涵体 磷酸化TDP-43免疫组化 ×
3运动神经元病4例患者的脑和脊髓组织泛素、TDP-43免疫组化染色所见例1、例2、例4的脑干和脊髓残留的运动神经元胞质见泛素阳性包涵体结构，主要表现为丝团样结构(图3)、圆形致密或球形包涵体(图4)、路易样包涵体。磷酸化TDP-43(pTDP-43)蛋白免疫组化染色结果显示，例1、例2的脑和脊髓存在明确的pTDP-43蛋白表达，其中例1脊髓前角pTDP-43阳性神经元及胶质细胞包涵体形态特征如图5、图6所示，大脑中央前回运动皮质pTDP-43阳性神经元及胶质细胞包涵体见图7，例2脊髓前角神经元也发现pTDP-43阳性包涵体(图8)，例4脊髓前角神经元存在pTDP-43弱阳性表达，例3脑和脊髓组织pTDP-43表达阴性。对照病例无一例发现泛素阳性或pTDP-43阳性包涵体。
讨论根据临床及病理组织学特征，运动神经元病通常分为ALS、原发性侧束变性以及进行性脊髓型肌萎缩，其中ALS最为常见，病程3～5年[1]。我们报道的这4例尸检病例中，例1以球部症状发病，其余3例均表现为肢体运动症状起病；例4临床上仅表现为下运动神经元症状，缺乏锥体束征，其余3例表现有上、下运动神经元损害的临床特征；4例病例的肌电图均为典型的失神经元变性表现；3例患者生前使用过不同时间的呼吸机人工机械通气治疗。
4例患者包括骨骼肌在内的所有组织学改变均符合经典的运动神经元病病理所见[1,11]。其中2例患者的脊髓前角神经元见到Bunina小体，较文献报告的Bunina小体阳性率稍低[3,12,13]，这可能与下运动神经元变性程度较重有关。
蛋白质病理学已成为散发型运动神经元病病理机制研究的重要方向[2,14,15]。在运动神经元病的蛋白质病理包涵体发现前，Bunina小体曾被认为是其较特征性的病理改变[3,12]，进一步研究发现它主要表达晶状蛋白-C和转铁蛋白[12,13]，并不表达泛素和TDP-43蛋白，形成机制尚不清楚。20世纪80年代末开始，不断有研究报道运动神经元病患者的脑和脊髓组织存在多种形态的泛素蛋白阳性神经元包涵体[3,13]，它不仅具有形态上的特征性，而且其分布特征与运动神经元病的组织损害分布特征一致。
因此，泛素蛋白曾被认为是研究运动神经元病蛋白质病理机制的关键蛋白之一，长期受到