遗传性耳聋相关基因突变检测试剂
注册技术审查指导原则
本指导原则旨在指导注册申请人对遗传性耳聋相关基因突变检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。
本指导原则是对遗传性耳聋相关基因突变检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。
本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行*事项，也不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要提供详细的研究和验证资料，相关人员应在遵循法规的前提下使用本指导原则。
本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。
一、适用范围
耳聋是一种常见的感觉障碍性疾病，耳聋病因复杂，目前研究认为约60％重度耳聋的发病与遗传有关。遗传性耳聋主要涉及四种遗传方式：常染色体隐性、常染色体显性、线粒体遗传、性染色体连锁遗传。按耳聋和言语功能发育的关系可分为语前聋和语后聋。言语功能发育之前发生的重度或极重度耳聋称为语前聋，在言语功能发育完成后开始的耳聋称为语后聋。一般来说，常染色体隐性遗传性耳聋表现为先天性聋或语前聋，常染色体显性遗传耳聋多表现为语后聋或渐进性听力下降。药物性耳聋、大前庭水管综合征等遗传性耳聋也可表现为后天迟发性。遗传性耳聋根据是否伴有多个系统病变分为综合征型耳聋与非综合征型耳聋，综合征型耳聋一般除了听力损伤外还伴有其他器官系统异常，表现为多种表型，与非综合征型耳聋相比其遗传背景更为复杂。目前遗传性耳聋中约有30%为综合征型耳聋，70%为非综合征型耳聋。其中，非综合征型常染色体隐性耳聋最常见，约占80%。
耳聋具有显著的遗传异质性，不同的种族中常见的致聋基因不同，进化过程造成了人种间遗传差异、人群迁徙和血源融合又导致了局部地区人群遗传背景的复杂化，中国耳聋人群中基因突变热点、突变谱、表型与基因型对应性与其他人种耳聋人群存在一定差异。在我国，约70%的遗传性耳聋变异来自于GJB2、SLC26A4、GJB3及线粒体DNA12SrRNA等4个常见致聋基因。目前常规建议进行的检测位点主要涉及4个基因的9个突变位点，具体为GJB2基因：c.35delG、c.delC、c.-dell6和c.-delAT；SLC26A4基因：c.AG和c.-2AG（IVS7-2AG）；GJB3基因：c.CT；12SrRNA基因：m.CT和m.AG。各位点相关情况如下：
GJB2基因：GJB2基因位于人类染色体13q11-12，其基因短小，包含2个外显子，编码个氨基酸，编码缝隙连接蛋白26，耳蜗缝隙连接蛋白的作用是维持内耳钾离子平衡，同时在内耳的生理功能中发挥非常复杂的作用，包括参与第二信使的转运及耳蜗内电位的产生。目前已发现的GJB2基因致聋突变超过个，是迄今为止在多个人种中最常见的致聋基因，国外研究认为常染色体隐性遗传性耳聋患者中，约有50%由GJB2基因突变引起。但是该基因致聋比例在不同人种中存在差异。其主要突变方式为缺失，其中，c.delC是中国人群中发生频率最高的突变，其他位点还包括c.-delAT、c.-del16、c.35delG等。
SLC26A4基因：又称PDS基因，位于人类染色体7q31,含有21个外显子，编码离子转运相关蛋白，在机体离子成分平衡的维持中发挥重要作用。该基因突变是导致前庭水管扩大（EVA）的责任基因，EVA是与儿童感音神经性聋相关的最常见的内耳畸形，大部分EVA患者变现为非综合征型耳聋（DFNB4），少部分同时合并甲状腺肿大，称Pendred综合征。对于该类患者往往变现为迟发性、渐进性，头部碰撞、感冒等会引起颅内压变化的活动都可能会引起听力下降。在我国，约96%的前庭水管扩大患者由SLC26A4基因突变导致，中国耳聋人群中该基因突变检出率为20.35%，目前发现的该基因致病突变众多，突变位点及突变频率存在地域和种族差异，在中国c.-2AG、c.AG为携带频率最高的SLC26A4基因热点突变，其次还有c.CT、c.GC、c.AT等。突变等位基因按外显子排名由高到低为：外显子7+8、外显子10、外显子19、外显子17、外显子15。发生在上述外显子上突变约占90.61%。
GJB3基因：位于染色体1p35-p33，编码缝隙连接蛋白31，是国内发现、克隆并鉴定的第一个耳聋相关基因，可以引起常染色体显性或者隐性遗传。主要突变形式有c.CT的无义突变和c.GA的错义突变，其可能与语后高频听力下降相关，目前国外对GJB3基因突变引起耳聋的报道较少。
线粒体DNA（mtDNA）突变：mtDNA是存在于细胞质中、独立于核染色体的基因组，由于受精卵所含有的mtDNA来自于卵子的细胞质，因此主要为母系遗传。在细胞复制过程中mtDNA突变随机分配，母亲-子代突变比例可能差异较大，mtDNA存在状态阈值，即只有突变型DNA达到一定负荷率或mtDNA功能缺陷到一定程度才会产生相应表型。由mtDNA突变而引起的耳聋包括综合征型耳聋和非综合征型耳聋，其中mtDNA12SrRNA上的m.AG、m.CT突变是氨基糖苷类药物致聋的易感位点，突变携带者对氨基糖甙类药物异常敏感，低剂量使用该类药物就可能会出现耳鸣，甚至严重的听力下降。此外，其他mtDNA突变还可能引起综合征型耳聋，例如母系遗传糖尿病伴耳聋等。
除上述列举的代表性基因突变外，至今已有众多其他耳聋相关的致病基因被克隆或鉴定，但还有很多耳聋表型的致病基因不清楚。随着科学发展，可能发现其他意义明确的耳聋表型相关基因和突变位点并应用于临床。
目前，遗传性耳聋基因突变检测在遗传性耳聋的辅助诊断以及新生儿遗传性耳聋基因突变筛查等领域有重要意义。例如通过对具有耳聋症状和/或体征人群，以及其他需要进行耳聋基因突变检测的人群，如有耳聋家族史的人群等进行耳聋基因突变的检测可用于遗传性耳聋的辅助诊断；对新生儿进行遗传性耳聋基因突变筛查，可作为常规物理听力筛查的补充，特别是可发现常规物理听力筛查无法检出的药物性致聋基因携带者和迟发性耳聋基因携带者，从而进行早期干预和指导等。
遗传性耳聋的诊断是一项复杂的工作，诊断流程包含常规诊断的病史采集、体格检查、辅助检查、对先证者及家系成员进行家系分析和遗传性检测等。
结合该类产品临床使用的实际情况，本指导原则的预期用途可为：用于体外定性检测人外周静脉血或干血斑样本中人基因组DNA的遗传性耳聋基因突变，用于遗传性耳聋的辅助诊断，或新生儿遗传性耳聋相关基因突变的筛查，具体预期用途应与产品临床验证相对应。
耳聋基因突变检测方法众多，国内应用较多的有高通量测序、飞行时间质谱、限制性酶内切法、荧光PCR法、微阵列芯片技术、PCR+导流杂交法等，其具体的检测原理存在差异，目前以仅包含PCR扩增反应或后续结合探针杂交反应进行位点检测的试剂盒较为常见，因此，本指导原则的技术要求适用于主要基于PCR扩增类（如荧光PCR法、微阵列芯片技术、PCR+导流杂交法）的检测试剂，对于其他检测技术（如PCR-质谱、高通量测序），申请人可以根据产品特性对不适用部分进行或补充其他的评价和验证，但需阐述不适用的理由，并验证替代方法的科学合理性。
本指导原则适用于进行首次注册申报和相关许可事项变更的产品。
二、注册申报资料要求
（一）综述资料
综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、研究结果的总结评价以及国内外同类产品上市情况介绍等内容。其中，需注意以下内容：
1.应明确检测位点的临床意义，尤其是对于新突变位点，应提交关于新增位点的临床意义的行业认可证据（如国内相关指南或专家共识）及支持性文献等，详述位点导致耳聋作用机制、遗传方式、突变后果、突变检出率以及中国人群数据等。
如新突变位点的临床意义未获行业认可，申请人应提供该基因新突变位点与耳聋表型相关的遗传学证据，包括但不限于：耳聋患者和正常人群的等位基因突变频率、耳聋患者家系共分离、生物信息学分析、权威数据库的信息等基于中国人群的充分的研究数据，以及基因突变和表型关系评估的资料，新突变位点应具有明确致病性。
2.详述检测原理、引物探针与检测位点对应关系以及结果判断等。
3.同类产品上市情况介绍部分应着重从方法学、检验原理、检测的突变类型以及临床意义等方面详细说明申报产品与目前市场上已获批准的同类产品之间的主要区别。
综述资料应符合《体外诊断试剂注册管理办法》（原总局令第5号，以下简称《办法》）和《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》（原总局公告年第44号），以下简称《44号公告》的要求。
（二）主要原材料的研究资料
主要原材料研究资料包括主要反应成分、对照品/质控品及企业参考品的研究资料。
1.此类产品的主要反应成分一般包括人基因组核酸提取/纯化试剂、检测所需引物、探针、酶、dNTPs以及杂交反应过程（如适用）中涉及的其他主要原材料（如标记用酶等）。申请人应提交各组分试剂中涉及的全部主要原材料的来源、筛选研究过程、制备过程、质量控制标准及检验资料等。如为申请人自制，应提交详细制备方法及过程，并应保证工艺相对稳定；如为外购，应注意明确原材料的供应商，并应提交供应商提供的原材料质量检定报告。
1.1核酸提取/纯化试剂（如有）的主要组成、原理介绍及相关的验证资料。
1.2引物、探针
申请人应详述引物、探针的设计原则、靶基因座位选择，同时应提供引物、探针核酸序列、模板核酸序列及两者的对应情况，建议设计多套引物探针以供筛选，针对待测位点检测准确性、特异性等功能性指标进行评价，选择最佳设计，注意应提交详细的筛选过程研究数据及分析过程。
申请人应针对选定的引物、探针原材料进行质量评价，一般包括：序列准确性、纯度（HPLC等）、浓度、探针荧光标记基团的激发波长和发射波长（如适用），以及功能性试验等，并依据评价结果建立合理的质量标准。
1.3酶
酶包括DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG）等。申请人应针对各种酶的活性进行验证，提交功能性试验资料，并确定酶的质量标准。
DNA聚合酶应具有DNA聚合酶活性，无核酸内切酶活性，具有热稳定性。UDG/UNG应具有水解尿嘧啶糖苷键的活性，无核酸外切酶及核酸内切酶活性。
1.4脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）
包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP或dUTP；应提交对其纯度、浓度等的验证资料，以及功能性试验资料，并确定质量标准。
1.5杂交用其他主要原材料（如适用）
根据具体产品提交杂交反应涉及的其他主要原材料的选择及验证资料，例如标记用酶/生物素、杂交液试剂中关键原料等，明确其来源及相应的技术指标要求。
2.对照品/质控品
试剂盒应根据检测原理设置各种对照品（质控品）、质控探针（如适用）实现对产品整个反应体系的有效监控。对照品通常包含阳性对照、阴性和/或空白对照，其中阳性对照一般应至少包括代表性的突变位点和突变类型。对于PCR扩增后需要采用探针杂交进行位点检测的试剂，还应建立对杂交过程的质控体系。
如该类产品所采用的方法学和检验原理显示：无论检测何种样本（野生型、杂合/异质突变和纯合/均质突变），其反应体系均可报出核酸序列结果，均可对检测的假阴性结果进行质量控制，则无需另外设置内标；否则，试剂盒应另外设置内标。
对照品可采用人基因组DNA、细胞系提取的基因组DNA或质粒等。阴性/空白对照应参与样本核酸的平行提取。申请人应提供对照品来源、选择、制备、基因序列确认等的详细研究数据，并对其检测结果做出明确的范围要求。质控探针/点涉及的主要原材料参照前述1.2及1.5进行。
3.企业参考品
企业参考品主要包括阳性参考品、阴性参考品、检测限参考品和精密度参考品等。申请人应提交企业参考品的原料来源、选择、制备方法、基因序列确认及检验标准的详细研究资料等。
3.1阳性参考品：阳性参考品应包含所有位点的突变型（至少包含杂合型），参考品建议采用临床样本、细胞系或临床样本提取的基因组DNA制备，需提交详细的细胞系构建资料，样本应明确其来源及型别确认资料。
3.2阴性参考品：建议包括野生型临床样本，可能产生交叉反应的同源序列（如有）以及检测范围外其他检测位点。参考品样本要求参照阳性参考品，如涉及纳入检测范围外其他罕见型别也可采用质粒。
3.3检测限参考品：浓度水平可选择最低检测限附近水平，应包含所有位点的突变型（至少包含杂合型），对于线粒体突变，还应包含最低检出异质性比例。参考品样本要求参照阳性参考品进行。
3.4精密度参考品：建议至少包括低浓度水平的代表性的突变位点和突变类型（覆盖所有突变基因型）。参考品样本要求参照阳性参考品进行。
（三）主要生产工艺及反应体系的研究资料
主要生产工艺研究资料应提交工作液配制（引物、探针浓度、酶浓度、dNTPs浓度、缓冲液离子浓度等）及其分装和冻干（如有）、荧光标记（如有）、杂交芯片/杂交膜的制备（如涉及）、杂交过程所需的杂交液、显色液及相关缓冲液（如涉及）等工艺过程中各参数详细的选择及确认依据。生产过程应对关键参数进行有效控制，可采用流程图方式描述生产工艺，标明关键工艺质控步骤，并详细说明该步骤的质控方法及质控标准。
反应体系研究资料应提交反应条件的选择确定过程，包括样本采集、预处理（如有）、样本用量、试剂用量、PCR反应体系、杂交体系以及其他检测过程中涉及的反应条件/参数等的确定。如申报产品包含核酸分离/纯化试剂，应提交对核酸分离/纯化过程进行的研究资料。
同时反应体系研究资料中应提供可检测的总核酸浓度范围的研究/确认资料。即建议申请人还应对可准确检出的人基因组DNA浓度上限进行研究验证。
不同适用机型的反应条件如有差异应分别提交。
（四）分析性能评估资料
申请人应针对下述各项分析性能提交详细的评估资料，包括试验地点、适用仪器、试剂规格、批号、试验方法、试验样本（类型、来源、数量、处理方法、基因型和浓度确认等）、可接受标准、统计方法、试验数据及结论等。分析性能评估的实验方法可以参考国内外有关体外诊断产品性能评估的指导原则。
如试剂用于不同适用机型，需要在不同机型上分别进行性能评估。
1.适用的样本类型
如果试剂适用于多种样本类型，应采用合理方法对每种样本类型及添加剂（如抗凝剂）进行适用性的研究确认。对于不同的样本类型（如外周血和干血斑）应分别提交相应的分析性能评估资料。
2.核酸提取/纯化性能
在进行靶核酸检测前，应有适当的核酸提取/纯化步骤。该步骤应最大量分离和纯化目的核酸并尽可能去除PCR抑制物。无论检测试剂是否含有核酸提取/纯化组分，申请人都应对配套使用的核酸提取/纯化方法的提取效率和提取核酸纯度、浓度等做充分的研究验证，并评价该方法能否满足该类产品的要求。不同样本类型应分别进行核酸提取/纯化性能的研究验证。
3.检测准确性
应采用临床样本验证该类产品的检测准确性，样本类型与说明书声称的样本类型一致，应包含所有位点突变型，至少包含杂合型样本，尽量纳入纯合型样本，对于线粒体突变，应尽量纳入异质型。同时建议考察对复合突变样本/人工构建质粒的检出能力。
提供所有试验用样本来源、型别确认等试验资料。
4.最低检出限
该类产品的最低检测限可定义为：在满足一定的检测准确性和精密度的条件下，能够检出目标序列的最低人基因组DNA的浓度，如包含线粒体突变，还应考察特定核酸浓度下的最低可检出的突变比例（异质性比例）。
最低检测限确立：可采用常见突变类型的临床样本，对人基因组DNA样本梯度稀释，对每个浓度水平重复检测3～5次，可通过以%可检出的最低浓度作为估计检测限，然后在此浓度附近制备若干浓度梯度样本，每个浓度至少重复20次检测，将具有95%检出率水平浓度作为最低检测限。
最低检出限的验证：应对试剂盒涵盖的所有的检测位点进行检出能力的验证，至少包含所有位点杂合型临床样本。
对线粒体突变还应考察研究特定核酸浓度下的最低突变比例（异质性比例），研究时可采用均质突变与野生型混合制备系列不同异质性比例样本，考察在各固定核酸浓度下不同异质性比例的检出情况，并确定出可满足最低核酸浓度下可检出的最低异质性比例，应至少包含20次重复检测，达到95%的检出率。
应提供所有试验用样本来源、型别及浓度（含异质性比例）确定的方法等试验资料。
5.分析特异性
分析特异性受干扰和交叉反应的影响。申请人应对样本中常见的干扰物质和可能引起交叉反应的物质进行研究。
5.1交叉反应：应针对野生型、非人类基因组、核酸序列相近或具有同源性、以及其他易引起交叉反应的突变类型序列（如待测位点附近的其他突变位点、其他耳聋基因等）进行交叉反应研究。同时申请人还应验证检测范围内各基因及突变位点间的交叉干扰。申请人应提交交叉反应基因的选择依据（如耳聋基因背景、发病情况），说明交叉反应样本的来源/制备方法、核酸序列确认方法，提交详细的验证资料。
5.2干扰试验：应针对可能的内源和外源性干扰物进行研究。内源干扰物主要涉及血脂、胆红素、血红蛋白和白蛋白、胆固醇等，外源干扰物主要包括血液样本采集可能用到的抗凝剂、常用药物干扰等。针对不同样本类型，建议分别进行相应的干扰研究。
干扰试验可采用配对比对的方式，比较干扰样本和不包含或含正常浓度水平干扰物样本检测结果间差异。可通过在临床样本中人工添加干扰物质的方式，评价干扰物质对目标序列检测的影响，也可直接采集暴露于干扰因素后的受试者样本，进行干扰试验评价。对于线粒体突变，建议考察最低异质性比例下的干扰。建议申请人在每种干扰物质的潜在最大浓度（“最差条件”）条件下进行评价；如有干扰，应确定不产生干扰的最高浓度。
6.精密度
精密度评价应至少包含野生型及常见代表性突变位点和突变类型（覆盖所有突变基因）的临床样本。试验操作完全按照说明书执行，包含核酸提取/纯化等步骤（如有）。此外，如产品包含多个反应管，建议每个反应管均应进行精密度研究。精密度评价需满足如下要求：
6.1对可能影响检测精密度的主要因素进行验证，除检测试剂本身外，还包括分析仪器、操作者、地点、时间、检测轮次和试剂批次等。
6.2设定合理的精密度评价周期，对批内/批间、日内/日间以及不同操作者之间的精密度进行综合评价。如有条件，申请人应选择不同的实验室进行重复实验以对室间重复性进行评价。
6.3用于精密度评价的临床样本建议包含最低检出限水平和中/高浓度。最低检测限水平下，检出率应≥95%（n≥20）;中/高浓度水平下，检出率应≥%（n≥20）。
6.4申请人应对精密度指标评价标准做出合理要求，精密度指标可设置为CV等（如有）。
7.提供企业参考品验证资料：根据主要原材料研究资料中的企业参考品设置情况，采用三批产品对企业参考品进行检验并提供详细的实验数据。
（五）阳性判断值确定资料
建议申请人采用一定量的临床样本，结合产品特性采用受试者工作曲线或其他合理方法对申报产品用于结果判断的标准/临界值进行研究确认。阳性判断值研究应涵盖野生型和所有检测位点的突变型（至少纳入杂合型）。同时应提供内标（如适用）的研究资料。
对于某些检测方法学，阳性判断值研究可能不适用，申请人应说明理由。
应提交详细的研究方案（包含临床样本的来源、型别确认等资料）、试验数据和统计分析过程。
（六）稳定性研究资料
稳定性研究资料主要包括申报产品的稳定性研究和适用样本的稳定性研究两部分。前者主要包括申报产品的实时稳定性、开瓶/复溶稳定性及冻融次数限制的研究等；后者则是指适用样本的保存条件和保存时间等的研究。如核酸提取液可保存，还需对核酸提取液的保存条件和保存时间进行研究。
实时稳定性研究应采用至少三批样品在实际储存条件下选取多个时间点进行产品性能评价，应持续进行至成品有效期后，从而确定产品保存条件和有效期。
（七）临床评价资料
临床试验应满足《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》（原国家食品药品监督管理总局通告年第16号）的要求，如相关法规、文件有更新，临床试验应符合更新后的要求。下面仅说明该类产品临床试验中应