背景
免疫球蛋白mu结合蛋白2（IGHMBP2）[OMIM]中的罕见变异（RV）可引起遗传性周围神经病Charcot-Marie-Tooth（CMT）疾病[OMIM]，常染色体隐性遗传。与CMT相关的40多个不同基因具有不同的遗传模式。
方法与结果发现一名11岁运动迟缓的女性患有远端萎缩，无力、无反射，无球囊或感觉异常。全外显子测序（WES）发现一个遗传自母亲的IGHMBP2（c.TC），可能具有致病性，未鉴定出该基因的其他变异。
全基因组测序（WGS）也发现了先前鉴定的IGHMBP2（c.TC），并且得到一个父系遗传的IGHMBP2（c.+CA）。预计这将激活一个扰动IGHMBP2剪接的隐蔽剪接位点。生信分析和RT-PCR结果均显示其激活了一个新的剪接位，引起转录本异常提前终止编码，导致功能不全。
结论本文证明了WES和传统分析的不足，显示了利用WGS和功能研究的优势。
Charcot-Marie-ToothDisease（CMT）是一组遗传性周围神经病，可分为脱髓鞘病和轴突病。各种类型的CMT都具有萎缩和无力的临床特征，主要影响远端肌肉，并伴有反射力减弱和不同程度的感觉受累。免疫球蛋白Mu结合蛋白2（IGHMBP2）[OMIM]突变是CMT的病因之一。IGHMP2是依赖ATP的DNA和RNA解旋酶，在神经元细胞体中高表达。IGHMBP2中的罕见突变（RV）通常会干扰核糖体结合或解旋酶的ATP酶活性，从而导致异常的RNA加工，会导致α运动神经元变性。IGHMBP2基因中的RV具有表型异质性，通常被分为两种不同的临床表型。一种是伴有1型呼吸窘迫的脊髓性肌萎缩症（SMARD1）[OMIM]。另一个是CMT2S[OMIM]，表现较轻，远端肌肉萎缩，无反射力虚弱，感觉受累相对较小。这些临床变异之间的基因型-表型相关性较差。
方法与结果
患者出生后发育正常，大约3个月大时父母注意到她的脚倒立。6个月时可以坐；12个月会走，但需要踝足矫形器来协助下肢活动。到18个月时，父母担心她肌肉无力，骨科和神经病学评估表明外翻、小腿萎缩和下肢反射减弱无力。0个月时对大脑和脊柱进行了MRI检查，结果正常。3岁时基础和代谢实验室评估正常，包括血浆酰基甘氨酸，酰基肉碱，游离和总肉碱，氨基酸，超长链脂肪酸和尿液有机酸。患者还接受了肌电图检查和神经传导研究，这些研究与运动性轴索性多发性神经病或前角细胞疾病的变体相符，远端发现更为严重。4岁时肌肉活检显示出严重的神经源性萎缩，并伴有再生迹象，这也与运动神经元多发性神经病或前角细胞疾病相一致。在急诊室接受了可能的癫痫发作的评估，据称是强直姿势的凝视发作。大约六个月后，在发烧的情况下，她又发生了一次类似的发作。脑电图异常，经过Keppra手术后没有发作。在接下来的几年中，她继续进行多次就诊，最终被诊断出患有偏头痛。5岁时接受了肺科检查，除患病时清除分泌物有一些轻度困难外，并未发现呼吸问题。5岁时，在遗传病诊所就诊。当时主要的考虑3型脊髓性肌萎缩症（SMA）和CMT。3型SMA测试为阴性。
9岁时接受全外显子组测序（WES），发现遗传自母亲的IGHMBP2（NM_.2），c.TC；p.LeuPro，Exon12，ACMG评级为VUS,。该变异已有文献报道，在IGHMBP2中有两个复合杂合错义突变的病人中有致病性。WES还揭示了CACNA1H基因的两个变异，可能是她癫痫发作的原因。她被转介到未诊断疾病网络（UDN）进行进一步评估。
在接受UDN评估时，发现持续走动困难和反复跌倒。患者有短距离行走的能力，但不能跑和跳。由于虚弱，难以完成精细的运动症状似乎没有进行性或疲劳性，没有延髓或感觉症状。神经系统检查显示精神状态和颅神经功能正常，但对称弥漫性肌无力，与近端相比，远端更突出，远端四肢萎缩。肌张力正常。双脚步态狭窄，膝盖被锁住，脚向侧面偏移。
通过UDN进行全基因组测序（WGS）并使用Opal软件（FabricGenomics）进行数据分析，除发现先前报道的遗传自母亲的IGHMBP2错义变异外，还发现了一个遗传自父亲的非编码区变异（c.+CA）。预计该内含子变体会激活一个隐性受体位点。两种变异均经过Sanger测序验证。
使用HumanSpliceFinder软件将隐性受体剪接位点与下游内源性受体剪接位点进行比较，发现隐性位点和内源性位点的强度相似，分别为91和87。在有和没有嘌呤霉素的情况下，使用患者淋巴细胞进行了IGHMBP2mRNA的RT-PCR分析，嘌呤霉素是无意义介导的衰变（NMD）的抑制剂。表明内含子8变异位点的剪接被破坏，证实它激活了内含子隐性受体位点。
重要的是，我们观察到迷你假外显子在IGHMBP2cDNA中的整合，对应着内含子8序列有个碱基的添加。包含个碱基对的假外显子会导致阅读序列发生移码，从而导致过早的终止密码子。在缺乏嘌呤霉素的情况下，转录物与另外的个碱基对的假外显子不存在，表明父亲等位基因单倍缺乏，仅留下了可编码无功能蛋白的母亲遗传的IGHMBP2转录物。
研究结论
当前患者的临床表现与CMT2S型（OMIM）一致，但是包括WES在内的全面评估显示，IGHMBP2基因中只有杂合变异体。通过将WGS数据与生信分析和功能验证相结合，我们找到了遗传自父亲的深度内含子突变，该变异体与先前确定的遗传自母亲的突变一起导致了该患者的CMT2S。在该患者中进行诊断的困难有以下几点。
首先，尽管具有良好的特征和独特的临床表型以及可供检测的家庭成员，但仍然无法通过WES得到致病基因。因为WES不能捕获内含子变异。这说明了WGS在某些患者评估中的重要优势，因为WGS可以检测非编码区的变异。
其次，需要使用嘌呤霉素进行RT-PCR分析，以证明未报告的非编码变体（c.+CA）破坏了剪接并过早的产生了终止密码子（PTC）。另外，需要进行不使用嘌呤霉素的孵育以显示该PTC导致NMD途径的激活和父本等位基因的血细胞功能不全，从而导致患者仅具有来自母本等位基因的转录本，这些转录本带有先前报道的致病变异。
第三，尽管WES检测阴性，但准确的临床判断仍提示诊断。如上所述，该患者的表现在临床上与CMT类型一致。知道WES在IGHMBP2基因中检测到一个导致CMT2S的候选变体后，UDN团队便通过WGS分析将注意力集中在该基因上，以确定是否可能存在未被检测到的非编码父本变体。即使通过WGS检测到此变体，也需要功能证明来确定预期的剪接效果。只有在合理的临床判断指导下，此类功能分析才可行。
最后，这种情况为具有相似表型的患者提供了另一种诊断可能性。就我们所知，我们的研究是IGHMBP2复合杂合突变致病的第一个报道，其中一个变异在深度内含子区域并影响剪接。在这项研究中确定的新型剪接变体扩大了IGHMBP2的突变库，便于将来病例的分子遗传学检测。
该案例说明了临床诊断，可用的临床遗传学研究（单基因测序，WES，WGS和del/dup分析）和研究能力之间不断变化的边界。虽然现在已将WES用于诊断目的，但我们的案例进一步强调了WGS的价值及其在编码和非编码区域识别新颖和罕见变体的能力。在WGS或WES之间进行选择并不容易。WES价格便宜且易于获取，但在这种情况下，可能会遗漏非编码区中的致病突变。
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