背景
丙酮酸激酶是调节糖酵解的最终限速步骤,有四种亚型(PKM1、PKM2、PKL和PKR)。其中PKM2在癌细胞等增殖细胞中高表达,通过糖酵解在癌细胞新陈代谢和细胞增殖中起关键作用;此外,PKM2还具有非代谢功能,其水平和活性的增加与肿瘤细胞的运动和迁移增强有关。PKM2这些重要的代谢和非代谢功能主要存在于癌细胞中,而在正常细胞或缺血性卒中等脑损伤反应中尚不清楚。还有一些研究表明,PKM2在应激条件下通过调节细胞代谢和促进血管生成来协调组织再生,以应对各种损伤和应激。基于以上背景,作者探讨了PKM2是否可以作为治疗剂在脑缺血动物中发挥脑保护作用。
结果
一、PKM2对缺血性卒中小鼠的急性神经保护作用
小鼠局部缺血卒中模型在缺血3天后在右侧感觉运动皮质形成梗死。于卒中后1h或24h鼻内注射重组PKM2(rPKM2),1h可明显减轻脑梗死的形成,而在24hPKM2的神经保护作用消失。
二、正常和卒中小鼠脑内PKM2的表达及rPKM2对STAT3磷酸化的影响
虽然24h点PKM2没有显示出神经保护作用,但作者认为其能帮助脑组织修复,为证明PKM2可用于长期治疗,作者测定了PKM2在正常脑和卒中脑中的表达水平。卒中后1d,卒中脑中PKM2水平一过性升高,卒中后7d,PKM2水平逐渐下降至较低水平,自卒中后1d起鼻腔注射rPKM2至7d可使PKM2水平显著高于正常对照组,但其缺血区皮质梗死面积无明显变化。
PKM2可以激活癌细胞中STAT3及其下游基因的转录。作者因而研究了卒中后7d缺血脑中rPKM2对STAT3信号的影响。WB显示,与模型组相比,rPKM2治疗使STAT3磷酸化水平明显升高,应用STAT3磷酸化抑制剂BP-1-后pSTAT3水平显著低于rPKM2组。
图1正常和卒中脑内rPKM2的神经保护作用及PKM2的表达水平。A脑切片TTC染色及梗死率统计。B正常和卒中脑内PKM2水平的Westernblot分析。C卒中后14d,模型组及rPKM2治疗组梗死区周围PKM2的表达。D卒中后7d梗死区STAT3表达的磷酸化水平。
三、rPKM2通过STAT3促进缺血性卒中后血管生成
接下来作者验证了rPKM2是否通过激活STAT3信号来促进缺血脑内血管生成。作者通过GLUT-1和BrdU免疫组化染色表示血管生长。相较模型组,rPKM2组在梗死区有更多的GLUT-1/BrdU标记细胞,给予BP-1-后GLUT-1/BrdU标记细胞显著减少,表明PKM2对血管生成的促进作用在很大程度上是通过STAT3信号介导的。
由于整合素αvβ3在血管内皮细胞上表达,并在血管生成过程中起重要作用,作者观察了rPKM2治疗对卒中后整合素αvβ3表达的影响。卒中后14d梗死区αvβ3阳性面积低于对照组,rPKM2治疗后可恢复整合素αvβ3水平,而用BP-1-抑制STAT3可阻断PKM2的作用。以上结果表明rPKM2通过激活STAT3信号促进了缺血脑内血管生成。
图3rPKM2促进缺血性卒中后血管生成。免疫组化染色检测梗死周围皮质的血管标志物。A卒中后14d,对照组、卒中组和实验组的血管内皮细胞标记物GLUT-1(绿色)和增殖标记物BrdU(红色)的免疫染色图像。BGLUT-1和BrdU标记的共聚焦图像。CGLUT-1/BrdU标记细胞的定量数据。D卒中后14d梗死区血管生成因子整合素αvβ3(红色)的免疫组化染色。E共染色整合素αvβ3(红色)和细胞外基质标记物IV型胶原。F整合素αvβ3的表达定量。
四、rPKM2通过FAK促进体外细胞迁移
STAT3信号除了有血管生成的作用,在中枢神经系统的神经发生也发挥关键作用,包括神经干细胞迁移和神经元分化。整合素和粘着斑激酶(FAK)是细胞迁移的关键分子。作者观察了rPKM2对C57/BL6幼鼠脑神经前体细胞(NPCs)整合素β1表达和蛋白激酶磷酸化/活化的影响。WB显示rPKM2可使NPCs中整合素β1的表达水平升高、FAK磷酸化程度增加。此外,免疫组化实验中,NPCs表达未成熟神经元标志物Nestin和DCX;Transwell实验中,rPKM2预处理增加了NPCs迁移到底膜的数量,表明rPKM2可促进细胞迁移和神经元分化。
图4rPKM2增加神经前体细胞的迁移因子和迁移。AWB检测rPKM2作用24h和48h后神经前体细胞整合素β1和粘着斑激酶FAK活化的蛋白水平。B、C蛋白印迹结果定量。D、E神经前体细胞的未成熟神经元标志物Nestin(绿色)和DCX(红色)的免疫组化染色。FTranswell迁移实验检测rPKM2对神经干细胞迁移的影响。
为进一步了解rPKM2对细胞迁移影响的分子机制,作者在Transwell试验中用rPKM2处理野生型(FAK+/+MEF)和FAK基因敲除的小鼠胚胎成纤维细胞(FAK-/-MEF),rPKM2可显著增加FAK+/+MEF迁移到底膜的数量,而在FAK-/-MEF没有这种促进作用,这些结果表明FAK在rPKM2对细胞迁移的影响中起着重要的中介作用。
图5敲除FAK可阻断rPKM2在小鼠胚胎成纤维细胞中的迁移作用。ArPKM2对FAK+/+和FAK?/?迁移的影响。蓝色:细胞核标记Hoechst,红色:细胞骨架标记Acti-stain55Palloidin。B细胞迁移结果的定量。
五、rPKM2促进缺血脑内神经干细胞迁移和神经元分化
接下来作者在局部缺血卒中小鼠中检测了rPKM2对神经干细胞迁移的调节作用。卒中后14d免疫组化结果显示,rPKM2治疗的小鼠增殖标记物DCX/BrdU标记细胞数量明显增多,表明细胞增殖显著增多;成熟神经元标记物NeuN和增殖标记物BrdU共染色显示,rPKM2治疗的小鼠有更多的BrdU阳性细胞和Neun/BrdU标记的细胞,而应用BP-1-可阻断rPKM2对缺血脑内神经元分化的影响。
图6rPKM2治疗促进了小鼠缺血性卒中后的神经发生和神经干细胞迁移。A用迁移神经前体标记物DCX(绿色)和增殖细胞标记物BrdU(红色)检测卒中后14d同侧SVZ至缺血皮质的神经母细胞沿白质的迁移和再生。B从SVZ到最远的共标DCX和BrdU阳性细胞的迁移距离。C、D卒中后14d迁移路径上DCX/BrdU标记细胞的共聚焦图像。E卒中后14d成熟神经元标志物Neun(绿色)和BrdU(红色)免疫组化染色。F、G各组梗死周围区共焦图像中NeuN/BrdU标记细胞的数量。
六、rPKM2促进缺血性卒中后局部脑血流恢复和行为恢复
为验证rPKM2促进神经发生是否可以改善卒中后的功能,作者测量了梗死周围区域的脑血流量(LCBF),并使用除胶测试测量了感觉运动功能。卒中后14d,模型组LCBF为卒中前基础水平的80%,rPKM2治疗的小鼠LCBF水平显著升高,BP-1-与rPKM2共应用可阻断rPKM2对LCBF的影响;除胶测试中,rPKM2治疗的小鼠感觉贴纸和移除贴纸的时间都明显缩短,这表明rPKM2治疗改善了中风动物的感觉运动功能。与其他结果一致,STAT3抑制剂BP-1-减弱了rPKM2的有益影响。
图7rPKM2促进缺血性卒中后LCBF恢复并减轻行为障碍。A卒中后14d测量梗死周边区域的局部脑血流量(LCBF)。B根据LCBF平均值与卒中前LCBF的比值计算各组LCBF恢复情况。C、D于卒中后3d和14d进行脱胶试验评定感觉运动功能。
结论
本研究将重组PKM2(rPKM2)注射到缺血脑内,以探讨其临床应用的可行性。作者测试了参与细胞存活和再生的PKM2下游信号,如STAT3和其他再生因子对PKM2作用的可能性。PKM2可以调节粘着斑激酶(FAK)等关键粘附/迁移因子,从而加速细胞迁移。本文支持rPKM2可以作为急性神经保护的早期卒中治疗和通过激活下游细胞内信号通路促进血管生成、神经发生和功能恢复的延迟性卒中治疗。
撰文:孙红
排版:周志豪
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