使用OCT血管造影对微血管异常进行表征
USH2A和MYO7A中有双等位基因变异的患者：
AhmedM.VasileiosTheofylaktopoulos，SarahHouston，AndrewR.Webster，Adam·M.Dubis，MariyaMoosajee
英国伦敦Moorfields医院NHS基金会信托
英国伦敦大学学院眼科研究所
英国伦医院
作者：
MariyaMoosajee，MBBS，理学士，博士学位，FRCOphth
伦敦大学学院眼科研究所
巴斯街11-43号
伦敦EC1V9EL
m.moosajee
ucl.ac.uk英国眼科杂志
内容提要/预告
OCT血管造影检测到USH2A和MYO7A患者视网膜丛的毛细血管密度降低。在MYO7A中检测到脉络膜毛细血管缺损，而在USH2A中未检测到。血管密度降低与*斑敏感性异常有关，并在椭球区消失。
抽象
目的：使用光学相干断层扫描血管造影（OCTA）来表征MYO7A和USH2A突变患者的视网膜丛和脉络膜毛细血管（CC）中的微血管变化，并与基因型，视网膜结构和功能相关。
方法：对27例经分子确诊的USH2A（n=21）和MYO7A（n=6）突变的患者使用AngioVue进行了*斑6×6mmOCTA。还进行了海德堡光谱域OCT扫描和MAIA显微视野测定，记录了保留的椭球区（EZ）带宽和平均*斑敏感性（MS）。分析了视网膜内侧的OCTA，浅层毛细血管丛（SCP），深层毛细血管丛（DCP）和CC。根据视网膜循环的OCT面血管造影照片计算血管密度（VD）。
结果：包括48目USH2A（n=37，平均年龄：34.4±12.2岁）或MYO7A（n=11，平均年龄：37.1±12.4岁），以及来自18位年龄匹配的健康参与者的35目。与对照组相比，USH2A和MYO7A突变患者的视网膜循环中VD显着降低（p0.）。SCP和DCP均观察到变化，但USH2A和MYO7A组之间未发现视网膜灌注差异。在USH2A组的CC中未检测到血管缺损，但从生命的第四十年开始，在老年MYO7A患者中检测到外周缺损。DCP中的VD与MS和EZ宽度密切相关（Spearman的rho分别为0.64和0.59，p0.）。
结论：OCTA能够检测出USH2A和MYO7A突变患者的视网膜微血管变化。CC通常受MYO7A突变影响。OCT血管造影可能会进一步增进我们对遗传性眼病的了解，还有他们的表型-基因型关联
介绍
Usher综合征（USH）是一种以常发性为特征的常染色体隐性遗传疾病，感觉神经性听力减退和视网膜色素变性，伴或不伴前庭功能障碍。USH的患病率估计为1：12,-28,，是导致产生超过50％合并聋盲患者的责任原因。视网膜色素变性（RP）是杆和锥的进行性色素变性，导致视力丧失的感光器。患者通常患有夜视，然后周围视力收缩，最终被这种疾病导致中枢视力丧失。眼底检查经典地揭示了色素改变的三联征（骨针）位于中周，蜡状浅视盘和全身小动脉衰减。
Usher综合征通常根据年龄分为三种临床亚型发病，严重程度和前庭特征。1型（USH1）最严重，严重听力和前庭功能丧失的疾病形式，发病在童年时期。Usher类型2（USH2）是最常见的类型，其特征是在青少年/成年早期通过部分听力丧失和RP表现，但前庭功能完整。USH1和USH2患者的听力损失往往是非进行性的。相反，3型Usher综合征（USH3）表现为缓慢进行性听力，随RP引起的前庭功能障碍的丧失和程度改变。
迄今为止，USH已与至少19个基因座和16个致病基因确定相关联。MYO7A和USH2A基因中的突变是导致USH这种情况最常见的原因，分别占USH1的50％和USH2的70％。MYO7A和USH2A基因分别编码肌球蛋白VIIa和usherin。两种蛋白质对于耳蜗毛的结构和功能完整性都是必不可少的内耳细胞和视网膜中的感光细胞。肌球蛋白VIIa在视网膜色素上皮（RPE）以及前庭小细胞和*斑中进一步的表现。USH2A突变也与非综合征性常染色体隐性RP相关，而MYO7A与非综合征性听力损失相关。
已经引入了几种治疗USH的治疗方法，包括基因增强疗法，无义抑制疗法，以及释放睫状神经营养因子（CNTF）的细胞疗法。但是，需要可靠和客观的测量来评估疾病的进展并确定未来临床干预措施的结果参数。光学相干断层扫描血管造影术（OCTA）最近作为OCT技术的无创功能扩展而被引入，它具有提供深度分辨的可视化和定量化视网膜和脉络膜微脉管系统的能力。OCTA用于研究患有以下疾病的患者的单个视网膜神经丛以及脉络膜毛细血管（CC）RP。通常在浅表层观察到血管密度降低RP患者的毛细血管丛（SCP），深毛细血管丛（DCP）和CC。据报道视网膜灌注与视觉功能有关。然而，这些研究包括了患者的分子未证实或基因型异质的队列。考虑到退化率和基因型之间的已知差异，这种异质性会抑制对血管变化作为疾病指标的评估。
在这项研究中，我们旨在表征浅表和深层视网膜毛细血管丛中的血管变化，以及一组具有MYO7A和USH2A基因突变的患者的脉络膜循环。我们还将调查这些患者的血管，结构和功能变化之间的关系。
材料和方法
研究人群
在年5月至年12月之间，从Moorfields医院招募了27名在USH2A（n=21）和MYO7A（n=6）中证实有双等位基因变异的患者。该前瞻性观察研究还包括18名年龄匹配的健康参与者。该研究获得了国家研究伦理委员会的批准，所有参与者均知情同意参加。遵守所有学习程序，宣言宗旨，完成于赫尔辛基。患者的排除标准包括是否存在除RP以外的任何视网膜疾病，或无法获得可靠的OCTA扫描。根据以下条件选择健康对照参与者：（i）缺乏任何可以解剖或解剖学改变的视网膜疾病，例如青光眼，糖尿病性视网膜病和/或视网膜脱离；（ii）获得OCTA扫描的能力；（iii）LogMAR最佳矫正视力（BCVA）≤0.3，并且（iv）没有重大眼外伤或手术史。从患者那里获得详细的病史，并进行了全面的眼科检查，包括LogMARBCVA和裂隙灯检查。每个参与者的两只眼睛都包括在内。
OCT和OCTA收购
使用SpectralisHRA+OCT机器（德国海德堡海德堡工程公司）从患者那里获得了高分辨率的OCT线扫描。扫描方案进行20°x20°（?6.3mm）体积扫描（次B扫描，每个包含次Ascan）。检查图像体积以确保获得水平凹凹扫描。所有参与者均使用市售的OCTA扫描，光谱域OCT系统（AvantiRTVueXR机器，OptoVue，Inc.，Fremont，CA，USA）。该系统的采集速度为70kA扫描/秒，*斑6x6mm扫描。通过正交配准和合并1xfast和1y-fast扫描创建每个数据集。使用商业版裂谱仪检测血流振幅相关血管造影（SSADA）算法。扫描收集则是传统的x扫描或高密度（HD）x扫描。
微视野
使用*斑完整性评估（MAIA，CenterVueSpA，意大利帕多瓦）对患者的*斑敏感性进行了测试。使用默认的（专家测试）中观协议。刺激是高德曼III号，演示时间为毫秒。通过4-2策略在分布在3个同心圆上的37个点上获得了敏感度，这些同心圆覆盖了直径为10度的区域。平均*斑敏感性（MS）为使用仪器在37个点上根据测得的灵敏度计算得出所有微视野检查结果均经过基于固定的质量控制检查，以确保可靠性。排除高固视率（30％）的检查。*斑完整性指数是指与年龄匹配的正常值相比，*斑敏感性发生统计学上显着变化的可能性的数值。收集定性的平均敏感性和*斑敏感性值和图评估与OCT和OCTA值的共定位。
数据处理
使用HeidelbergEyeExplorer（HEYEX）软件查看并分析了光谱结构的OCT图像。选择穿过中央凹中心的B线扫描，然后由专业的分等师从横截面OCT图像中手动识别出椭球区（EZ）带的延伸，并测量保留的EZ的宽度。
使用OCT检查OCT血管造影扫描的图像质量和分割ReVue软件（OptoVue，Inc.，美国加利福尼亚州弗里蒙特）。低质量扫描（Q值小于5/10，明显的运动伪影，散焦或不居中）被排除在分析之外。由于USH视网膜发生重大病理变化，自动分割经常失败，需要手动校正。视网膜在内部限制膜（ILM），内部丛状层（IPL）和Bruch膜（BM）。由于外部丛状层（OPL）的外部边界分割在技术上由于视网膜广泛变性和可视性差而难以进行，分割后的BM上方25μm（BM-25μm）被用作内部视网膜的外边界平板通过在特定平板上最大程度地投影流量信号来生成OCT面血管造影照片。视网膜内平板被定义在ILM和BM上方25μm之间。然后将视网膜循环细分为浅表和深层毛细血管丛。SCP位于ILM和IPL（IPL-9μm）上方9μm之间。检测到DCP在IPL-9um和BM-25μm之间。定义脉络膜毛细血管（CC）平板介于BM-9μm和BM+31μm之间。
然后使用ReVue软件中的“导出血管”工具将面部血管造影图像导出到PNG文件中，以便使用自定义的Matlab和ImageJ例程进行分析。由于视网膜变性，表层的较大血管部分移位并出现在DCP平板中，可能会干扰流量信号的精确定量。因此，确定了大血管占据的区域，并从DCP血管造影分析中排除了这些区域。血管密度（VD）是从手动居中的直径0.6mm的中心凹无血管区域（FAZ）之外的6mm直径环形区域内的阈值血管造影照片测得的。VD定义为包含流量信号的像素所占面积的百分比。FAZ被排除在分析之外，以避免受试者之间FAZ区域的正常变异。
统计分析
所有统计分析均在SPSSv.25.0（IBMCorporation，Armonk，NY，USA）和MicrosoftExcel（MicrosoftOffice，MicrosoftCorporation，Redmond，WA，USA）上进行。血管密度，保留的EZ宽度和平均*斑敏感度表示为每组纳入参与者的平均值和标准差（SD）。使用方差分析（ANOVA）测试评估组之间的年龄匹配。使用广义估计方程（GEE）来研究差异组之间。GEE测试说明了两只眼睛之间的对象内相关性。P值使用Holm-Bonferroni校正进行了多次比较调整。Spearman等级相关系数（rho）用于评估VD，EZ和MS之间的相关性。
结果
参与者特征，临床数据和遗传发现
来自27名双等位基因患者的48目（平均年龄±SD，35.0±12.1岁），MYO7A或USH2A基因的变体（有关突变的详细信息，请参见补充表1）。包括来自18位健康参与者的35目（平均年龄±SD，34.0±10.4岁）。大多数患者具有USH1或USH2的临床表现，但3例具有非综合征性常染色体隐性RP（ARRP）且无相关听力损失的USH2A患者除外（见表1）。患者和对照组年龄匹配（p=0.25，ANOVA）。在USH2A和MYO7A患者之间，中心视力没有统计学上的显着差异（分别为LogMAR±SD，0.31±0.18和0.19±0.23，p=0.26）。
表1.参加者的特征
年龄，LogMAR和轴长以平均值±标准差给出.USH1和USH2：分别为1型和2型Usher综合征，ARRP：常染色体隐性视网膜色素变性，LogMAR：最小分辨角的对数，N/A：不适用
OCT血管造影，结构性OCT和微视野检查
OCT视网膜循环血管造影的定性评估显示减少与对照组相比，USH患者的内部视网膜，SCP和DCP的毛细血管密度，减少的灌注在血管造影的外围区域更为明显，而在中心区域的血管则相对保留。在所有视网膜神经丛中，与对照组相比，患者的血管密度在统计学上有显着性降低（p0.，GEE）（表2）。但是，没有在MYO7A和USH2A组之间的视网膜血管造影中观察到显着差异（表2）。相比之下，USH2A和MYO7A患者的CC行为似乎有所不同。具有USH2A突变的患者在不同年龄组（19-55岁）中具有相对完整的CC层（B1-3），但一名USH2患者（56岁）的视网膜变性和RPE缺失明显，并伴有局部丢失CC。另一方面，MYO7A患者的CC血管造影显示从生命的第三个或第四个十年开始微血管变化。在6毫米血管造影的外围观察到CC丢失的区域，露出了较深且密度较小的大型脉络膜血管层（C2和C3中的白色箭头）。一环增加在完整的CC岛周围，保存并丢失了CC（C2和C3中的*色箭头）。
USH患者的横断面结构性OCT图像显示感光细胞丢失，EZ和扫描视网膜外围的外核层（ONL）的广泛变性可以明显看出这一点。USH患者平均显示±在中央凹中央的水平B扫描中保留了um的EZ带。MYO7A和USH2A患者之间的平均EZ没有观察到显着差异。
在所有患者中，尤其是在周围区域，经微视野检测发现的中视*斑敏感性降低（均值±SD，15.6±8.2dB），所有患者均被确认为*斑完整性指数异常，但一名患者“怀疑”完整性。MYO7A患者的平均*斑敏感性比USH2A患者低；但是，发现差异没有统计学意义（p=0.66，GEE）。
血管，结构和功能参数之间的相关性
结构性OCT上退化的视网膜区域在空间上与OCTA灌注不足和视网膜敏感性降低。视网膜神经丛的血管密度与平均敏感性和保留的EZ宽度显着相关。与深层神经丛相比，深层神经丛与OCT（Spearman的rho=0.59，p0.）和微视野检查（rho=0.64，p0.）的关联稍强。
表2.血管密度，EZ宽度和视网膜敏感性测量
P值基于广义估计方程（GEE，说明了眼内对象之间的相关性），并使用Holm-Bonferroni方法进行了多次比较。SCP：浅表毛细血管丛，DCP：深毛细血管丛，EZ：椭球区，MAIA：*斑完整性评估显微视野法，N/A：不适用
讨论
小动脉衰减是Usher相关性视网膜色素变性的经典征象。在我们的MYO7A和USH2A患者队列中，OCTA能够检测到视网膜丛的灌注减少，尤其是在较外围的区域，中央*斑相对保留。发现深部神经丛比浅表层受影响更大。尽管USH2A患者的脉络膜毛细血管似乎相对保留，直到在疾病的晚期，与健康对照组相比，MYO7A的这一层明显消失。还检测到外部视网膜变性和*斑敏感性降低，这与视网膜OCT血管造影图中测得的血管密度显着相关。尽管MYO7A患者的VA明显比USH2A患者差，但在OCT，OCTA或微视野参数方面未观察到显着差异。
RP的特征是棒状感光细胞逐渐退化，这种退化通常始于中周，在中心凹陷区域不累及视锥细胞，直至疾病晚期。这解释了感光带（ONL，外部限制膜和OCT截面的OCT），中心保留着相对的视网膜组织岛。感光细胞的死亡也可以解释出通过镜检法测定的*斑敏感性降低。继而在退化区域的新陈代谢需求减少之后，可以预期视网膜循环中的血管变化。在未分割的视网膜平板以及浅表和深层毛细血管丛的OCTA中观察到灌注减少。
根据已发表的有关视网膜中氧气代谢的实验，建议深层的视网膜毛细血管丛在一定程度上负责向感光细胞提供氧气，而先前的研究并未表明浅表神经丛与感光细胞的代谢之间存在联系。我们希望深层和中层毛细血管丛在USH中受到影响，但在浅层丛中不受影响。但是，商用OCTA机器遵循2层分割方案，将视网膜循环分为两个丛状。浅层和深层，将大多数中间毛细血管丛与
浅层平板。因此，在表层和深层都发现了变化丛。另外，外视网膜的广泛变薄将允许更高的氧扩散到视网膜层，从而导致视网膜血管的反射性自动调节收缩并降低了测得的血管密度。
由于OCTA的影响，通过OCTA量化CC本身在技术上具有挑战性。因此，本研究对CC平板进行了定性评估。与视网膜循环不同，两个USH组的脉络膜毛细血管有所不同，MYO7A患者的CC比USH2A组更早，更严重。长期以来，脉络膜血流一直被认为仅受氧气水平的最低程度的调节，因此，继发于神经视网膜变性的继发性代谢需求变化不会影响脉络膜血流。视网膜色素上皮（RPE）对于RPE特异性因子（例如血管内皮生长因子（VEGF）和色素上皮衍生因子（PEDF））的发展和维持CC完整性至关重要。已经发现，由USH2A基因编码的usherin蛋白在光感受器的内部片段中特异性表达，但在RPE中不表达。因此，在USH2A患者中，对于光感受器变性，RPE的结构最初是完整的，保持了CC层的活力。相反，肌球蛋白VIIa蛋白主要在RPE中表达，因此，在MYO7A疾病中，RPE将直接受到脉络膜毛细血管狭窄中随后出现的早期缺陷的影响。丢失CC边缘的血流信号增加需要谨慎地解释。这些区域可能对应于在CC丢失之前RPE被破坏，导致到达CC的OCT信号增加，从而导致OCT血管造影照片上的信号增加，而CC血流没有实际增加的区域。
文献中有相反的报道，要么提示RP中CC明显低灌注，另一方面，疾病组和健康组之间没有差异。这种差异可能是由于基因和表型异质的患者所致。广泛的病理生理机制。荧光素血管造影（FA），彩色多普勒超声检查，功能性MRI，双向激光多普勒测速，激光散斑成像和共聚焦激光多普勒血流测量等不同模式已显示出RP中眼血流量的改变。
在视网膜循环中，各种OCTA研究都报道浅表和深层神经丛血流信号减少，而DCP在一些研究中受到的影响更为严重。此外，Toto和Koyanagi及其同事观察到了更多的中央凹旁区域，但中央凹区不是，这与我们的发现是一致的。然而，Rezaei等人的一项定性评估浅表和深层视网膜层的研究，仅在深丛神经周围观察到血管缺损，而在严重的RP患者组中未观察到浅表层。此外，他们报告称他们的RP队列轻度受累人群中没有血管变化。这归因于OCT机器，图像处理方法，OCTA的变化平板定义以及RP患者特征的差异。
这项研究提供了有关血管灌注缺陷与结构和功能异常的相关性的有价值的信息，从而洞察了退化性视网膜内的残余血管功能。这对于理解和计划Usher综合征的治疗干预尤为重要。的确还存在一些限制，包括横断面设计和适度的参与者人数，尤其是在MYO7A队列中，因为这些是罕见疾病队列，可能需要更大的纵向数据研究来证实这些结果并更好地预测疾病的病理生理和进展。此外，使用OCTA本身就具有弊端，因为图像质量高度依赖于患者的状况和合作。因此，了解OCTA图像伪影对于正确解释和处理血管造影照片以及开发先进的图像分析工具至关重要。去除投影和运动伪像的算法，以及机器学习和平均技术已显示出可信赖的OCT血管造影图分割，可视化和量化结果。
总之，OCTA能够表征USH患者*斑区视网膜和脉络膜循环中微血管的变化。在MYO7A和USH2A患者的SCP和DCP中检测到血管密度降低。与USH2A患者相比，在MYO7A中更早发现绒毛膜毛细血管缺损，并且更常见。视网膜中的OCTA血管改变与OCT感光器变性和视网膜敏感性密切相关。我们的研究结果表明，OCTA可能会更好地了解视网膜色素变性的病理，生理以及血管异常与特定基因突变之间的关联。
备注
贡献者：研究概念和设计：AMH，AW，AMD，MM。数据收集：AMH，AM，JSG，JMNDR，VT，SH。统计分析：AMH。数据解释：AMH，AMD，MM。撰写文章：AMH。文章的重要修订：AMH，AM，JSG，JMNDR，VT，SH，AW，AMD，MM。本文的最终批准：AMH，AM，JSG，JMNDR，VT，SH，ARW，AMD，MM。
资金：这项工作得到了惠康信托职业发展补助金的支持。资助号/Z/16/Z，美国国立卫生研究院（NIHR）罕见病转化研究合作奖以及Moorfields的NIHR研究中心和UCL眼科研究所的支持。
免责声明：资助者在研究设计，数据收集，分析和解释，撰写文章或将论文提交发表的决定中不起作用。
竞争利益：未宣布。
患者同意发表：不需要。
出处和同行评审：外部同行评审。
数据可用性声明数据：可应要求提供。
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