在啮齿动物II型神经纤维瘤模型中，氯沙坦可预防肿瘤引起的听力损失并增强放疗疗效
1.通讯作者及单位:
LeiXu,美国，EdwinL.Steele实验室，放射肿瘤科，医院和哈佛医学院。
KonstantinaM.Stankovic，美国，伊顿-皮博迪实验室和耳鼻喉科，头颈外科，马萨诸塞州眼耳和哈佛医学院。
2.摘要：
听力损失是前庭神经鞘瘤造成的II型神经纤维瘤最主要的特征。II型神经纤维瘤患者的听力丢失和前庭神经瘤微环境中的纤维化有关。本研究提出假设：假设使用FDA批准的可阻断纤维化和炎症信号的抗高血压药物氯沙坦，能够减少纤维化并提高听力。研究中使用II型神经纤维瘤小鼠模型，发现氯沙坦能够通过（i）减少神经炎症IL-6/STAT3信号、阻止听力损失；（ii）使肿瘤血管系统正常化，减轻神经水肿；（iii）增加供氧量及提高放射治疗效能等方面以促进肿瘤微环境的正常化。为使该振奋人心的发现转化为临床应用，本研究使用患者样本和数据证明了IL-6/STAT3信号和听力功能存在负相关，在体外耳蜗组织培养中，肿瘤来源的IL-6的产生与耳蜗感觉细胞和神经元活力的降低有关。基于前庭神经瘤和高血压患者的回顾性分析，接受血管紧张素受体阻滞剂的患者与服用其他降压药或不服用降压药的患者相比，前庭神经瘤诱发的听力损失没有恶化。该研究为氯沙坦治疗前庭神经瘤患者的前瞻性临床试验提供了理论基础和关键数据。
3.背景：
II型神经纤维瘤(NF2)是一种显性遗传性肿瘤，由NF2肿瘤抑制基因的突变引起。NF2的特征是双侧前庭神经鞘瘤（VSs），逐渐发展将导致感音神经性听力损失(SNHL)转化为社交障碍和临床抑郁症。VSs可引起脑干受压，导致严重的发病率和死亡率。对于VSs的标准治疗包括手术和放疗，然而两种方法都存在神经损伤的风险并造成耳聋，面瘫，面部麻木，中风，甚至死亡。目前美国FDA没有批准用于治疗VS和听力丧失的药物。贝伐单抗是一种专门识别血管内皮生长因子a(VEGF-A)的人源化单克隆抗体，已被证明可以改善一些患者的听力。然而，贝伐珠单抗并不是对所有听力损失的NF2患者都有效，即便在那些有反应的患者中，效果也并不持久。此外，贝伐珠单抗可能引起严重的不良反应，如高血压和蛋白尿，使一些患者无法耐受长期贝伐珠单抗治疗。针对VS来说，尚需开发更有效的治疗方法，增强听力保护效果，降低*性。
研究NF2相关听力损害的最大障碍是研究者对神经鞘瘤导致听力损失的机制不完全理解。导致听力损失的机制是多因素的，包括：肿瘤对耳蜗神经的机械压迫、耳蜗血流受阻导致的听力器官缺血、肿瘤内出血、肿瘤分泌的耳*性分子和细胞外囊泡、肿瘤内在遗传环境的差异与听力的好坏有关、肿瘤微环境中NLRP3炎性小体的激活。先前一项对例VS患者的研究表明，出血相关肿瘤纤维化与听力损失有关。纤维化是由于过度沉积的细胞外基质(ECM)成分，如胶原和透明质酸(HA)，众所周知也是放疗所引起的组织损伤。在高纤维增生性恶性肿瘤中，肿瘤相关纤维化导致高固体应力——由癌细胞、间质细胞和致密外基质施加的物理力。由于肿瘤血管结构异常，它们在这种高压下塌陷，导致血流减少，损害药物和氧气的输送，并最终导致肿瘤微环境的缺氧。缺氧细胞更具侵袭性，对放疗和化疗药物更有耐药性，而放疗和化疗药物需要氧气才能有效。肿瘤微环境在非恶性肿瘤进展和治疗(如NF2VS)中的作用研究较少。降低基线和放疗诱导纤维化是否可以预防肿瘤引起的听力损失尚不清楚。
在本研究中，使用氯沙坦——一种被广泛使用的且经FDA批准的抗高血压药物，它可以阻断纤维性和炎性血管紧张素信号，从而重塑前庭神经瘤的肿瘤微环境。研究发现氯沙坦可以通过（i）减少巨噬细胞炎症信号（IL-6/STAT3/TLR4）、（ii）使肿瘤血管正常化以减少神经水肿来阻止小鼠前庭神经瘤模型中肿瘤导致的听力损失。通过分析74例不同听力能力患者的前庭神经瘤样本，发现IL-6/STAT3信号与听力功能和耳蜗感音神经细胞活力呈负相关。此外，回顾性分析表明患有高血压并接受血管紧张素受体阻滞剂治疗的VS患者与服用其他降压药或未服用降压药的患者相比，因前庭神经瘤引起的听力损失没有进一步恶化。为了改善II型神经纤维瘤（NF2）的治疗，发现在VS模型和患者来源的VS肿瘤移植模型中，在放疗中加入氯沙坦，通过使肿瘤血管正常化和减轻肿瘤缺氧，可以提高治疗结果，并通过控制肿瘤生长减少放疗的剂量。本研究为临床评价氯沙坦对VS患者听力功能的影响以及氯沙坦联合放疗提供了理论依据和关键数据。
4.内容：
（1）氯沙坦可减少神经鞘瘤模型中的基质含量，改善血管堵塞，减少缺氧
首先，在人体前庭神经瘤（VS）样本中，研究证实基质分子、Ⅰ型胶原和透明质酸（HA）在血旺瘤中大量表达。在肿瘤微环境中，Ⅰ型胶原是表达最丰富的胶原，透明质酸是一种糖蛋白，这两种分子在肿瘤微环境中都起着重要的结构作用。研究也证实了：氯沙坦的靶点血管紧张素原（AGT），即血管紧张素Ⅱ的前体分子和血管紧张素Ⅱ受体Ⅰ（AT1），在患者的VS组织中表达（Fig1A）。
小脑桥脑角(CPA)的NF2模型能够较好的复制肿瘤诱导的听力损失，氯沙坦治疗减少了I型胶原和透明质酸（HA）的表达（Fig1B、C、H）。同时也观察了血管灌注和胶原纤维以研究氯沙坦对血旺肿瘤血管的影响。研究发现肿瘤中胶原密度高，血管直径小，血管遭受压缩；氯沙坦治疗可降低纤丝胶原密度，增大血管直径（Fig1D），血管灌注增加（Fig1E、H）。氯沙坦治疗也增加了血管周皮细胞覆盖（Fig1F、H）。因为血管结构和灌注的改善，缺氧面积减少（Fig1G、H）。这些研究表明，氯沙坦使NF2肿瘤微环境中的细胞外基质和血管系统正常化。
（2）氯沙坦可以在桥小脑角神经鞘瘤模型中防止听力损失
本研究在桥小脑角NF2模型中，通过测量DPOAEs(反映外毛细胞功能)和ABR(代表听神经和中央听核的累加活动)来评估氯沙坦对听力的影响。在肿瘤大小相似的小鼠中(图2A)，发现氯沙坦降低了DPOAE和ABR阈值至非肿瘤小鼠的正常值(图2B)，表明氯沙坦治疗防止了肿瘤诱导的听力损失。
（3）氯沙坦治疗可减少神经元水肿
先前在NF2模型中的研究发现，抗VEGF（血管内皮生长因子）治疗可通过减少神经水肿以改善神经功能，进而促进肿瘤血管正常化（19）。基于此，本研究围绕氯沙坦对大脑和周围神经水肿的影响展开探索。本研究收集Nf2?/?小鼠整个携带肿瘤的大脑组织，在CPA（小脑桥角）中，发现与对照组和抗VEGF（血管内皮生长因子）治疗相比，氯沙坦治疗减少了脑水肿（Fig2C）。从Nf2-/-肿瘤小鼠的坐骨神经中收集位于肿瘤植入部位远端的胫神经，分析发现对照组胫神经水肿明显，神经周围区有大量局灶性液体，而氯沙坦治疗可减少神经水肿（Fig2D）。这说明氯沙坦可以通过减轻水肿改善听力功能，减轻对神经的压迫。
（4）氯沙坦治疗减轻VS（前庭神经鞘瘤）炎症反应
在Nf2?/?肿瘤中，观察到氯沙坦降低了诸多能够在听力损失中发挥作用的炎症因子的表达(22,25-30)，主要包括(i)调节炎症的分泌细胞因子，如IL-6、IL-1β、干扰素-g(IFN-g)、肿瘤坏死因子-a(TNF-a)、IL-3和IL-4;(ii)趋化因子及其招募炎症细胞的受体，如CCL1、CCL2、CCL4、CCR2、CCR4、CXCR3;(iii)活性氧(ROS)信号相关分子，如诱导型一氧化氮合酶、NADPH氧化酶3、瞬时受体电位阳离子通道亚家族V成员1和TLR4(图2E)。
CCL1、CCL2和CCL4是调节巨噬细胞迁移和浸润的关键趋化因子。由于氯沙坦减少了Ccl-1、Ccl-2和Ccl-4的表达，我们观察到在氯沙坦处理的Nf2-/-肿瘤中浸润性肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的数量减少（Fig2F）。
（5）氯沙坦治疗可减少肿瘤巨噬细胞中的IL-6/STATS和TLR4信号
该研究针对氯沙坦治疗的Nf2?/?肿瘤巨噬细胞进进行基于RNA测序(RNA-seq)的转录谱分析。发现研究涉及到的基因的高度富集和髓样树突状细胞的趋化性、胞外基质和粘附性以及血管生成有关（Fig3A）。功能分析显示，氯沙坦治疗肿瘤巨噬细胞可以抑制肿瘤生长和听力损失的多个驱动因素，包括炎症、纤维化、血管生成、信号转导和听力功能相关通路（Fig3B）。基因富集分析
(GSEA)发现表达下调的基因与SMAD2和SMAD3信号通路、神经炎症、IL-6/JAK/STAT信号通路和ROS合成通路相关（Fig3C）。
经氯沙坦处理的肿瘤分离得到的巨噬细胞中分析发现Il6,Tnfa,Ifng,Ilb,和Tlr4等mRNA表达下调（Fig3D）。以前研究表明，Il-6介导噪音环境下的内耳损伤，化疗诱发的听力损失，而TLR4会激活IL-6的转录。因此，本研究进一步证明，在肿瘤组织中，氯沙坦治疗（i）降低IL-6和TLR4的蛋白含量；（ii）降低IL-6下游JAK2和STAT3磷酸化水平，而升高JAK/STAT信号的负调控因子SOCS3；（iii）抑制PI3K/Akt和ERK1/2、MAPK信号通路（Fig3E、F）。本研究使用AngII、氯沙坦、或者AngII+氯沙坦处理野生型(Wt)或AngII受体1敲除小鼠(Agtr1?/?)中分离得到的腹腔巨噬细胞以检测血管紧张素通路是否直接调控巨噬细胞IL-6和TLR4信号通路。在野生型小鼠的巨噬细胞中，AngII诱发了IL-6和TLR4mRNA的表达，而氯沙坦的处理消除了该现象。在Agtr1?/?小鼠的巨噬细胞中，AngII未能诱导IL-6或者TLR4的mRNA表达（Fig3G）。
在心血管疾病模型中，IL-6和TLR4激活AngII会导致氧化应激，其特征是ROS的过量产生。氧化应激被认为是听力损失和化疗引发的肺纤维化的重要因素。在野生型小鼠的巨噬细胞中，AngII诱导巨噬细胞ROS信号产生，氯沙坦治疗消除了该信号。在Agtr1?/?小鼠的巨噬细胞中，AngII未能诱导ROS产
生（Fig3H）。
（6）VS患者NF2中IL-6/STAT3信号水平升高与听力功能呈负相关
利用人的VS组织样本研究发现，在听力正常和听力受损的的组织中，Ⅰ型胶原、HA、AT1、CCL2的表达并无差异（Fig4A），但相比于正常神经，这些蛋白的表达较高。听力较差的病人相比于听力较好或者正常人，肿瘤巨噬细胞的渗入更多，IL-6表达和STATS磷酸化更高（Fig4C、D），TLR4表达更高（Fig4E）。
（7）肿瘤来源的IL-6升高与耳蜗感觉细胞和神经元活力降低相关
本研究对收集到的57例VS患者的肿瘤样本（10例听力较好，47例听力较差）进行分析。发现肿瘤组织IL-6的表达并无差异（Fig5A），但当VS-CM（VS环境介质）应用于新生鼠耳蜗外植体时，VS-CM中的IL-6和毛细胞及神经突的生存能力呈现明显的负相关（Fig5B、C、D）。此前的研究建立了一个器官型新生鼠耳蜗外植体培养模型，使用患者VS-CM评估耳*性和神经*性因子（27）。研究发现在患者VS-CM中培养的耳蜗外植体呈现出的高浓度IL-6与基底期外毛细胞和神经突起活力降低相关（Fig5B、C）。以上说明肿瘤来源的IL-6可能参与了耳蜗损伤和相关听力损失。
（8）氯沙坦结合放疗相比于单独放疗更能有效抑制Nf2?/?神经鞘瘤
因为氯沙坦治疗能够增加氧合作用，而氧是一种强效的放射增敏剂，紧接着的研究尝试探讨结合氯沙坦治疗是否可以提高放疗疗效（Fig6A）。在Nf2-/-坐骨神经和CPA（小脑桥脑角）模型中，氯沙坦结合放疗抑制肿瘤生长，相比于单纯的放疗也能够在很大程度上提高小鼠的存活率，使得小鼠寿命延长近50%（Fig6B、C）。
（9）氯沙坦治疗联合低剂量放疗与高剂量放疗有着同样的疗效。
本研究也探讨了氯沙坦的使用是否可以降低放疗所需的剂量以及是否可以减轻放疗的副作用。在坐骨神经和小脑桥脑角模型中，发现高剂量（10Gy）的放疗效果优于低剂量的放疗（5Gy），但结合氯沙坦治疗后，低剂量的放疗和高剂量放疗呈现相同的疗效（Fig6D、E）。
（10）建立患者源性VS模型研究氯沙坦的疗效
为进一步说明氯沙坦的疗效，本研究采用六例患者来源的VS细胞。对样本进行分析发现，VS患者相较于正常人有个基因表达上调，而个基因表达下调(Fig7A)。且发现在VS当中和声音刺激、雪旺和胶质细胞分化、炎症负调控、IL-6的产生香瓜的基因下调表达，而与调控纤维化及肿瘤生长的信号通路相关的基因上调表达（Fig7B、C）。
将患者来源的VS细胞移植进入裸鼠进行造模，在6个患者来源的VS细胞移植模型中，有一个能够成功引发肿瘤。SB和Sox-10证实了其雪旺细胞来源（Fig7D）。利用该模型也证实了氯沙坦结合放疗比单独使用放疗移植肿瘤生长具有更好的效果（Fig7E）。
（11）与服用其他抗高血压药物的患者相比，伴有VS的高血压患者接受ARB（血管紧张素受体阻滞剂）治疗有更多的听力保留
高血压是VS手术患者的主要共患病。考虑到氯沙坦在NF2小鼠模型中的保护作用，本研究医院自.1—.10间的一组VS且伴有高血压的患者进行了回顾性分析。45例高血压患者符合正常基线听力要求，采用顺序测听法对之进行长期听力监测。其中有7人在VS初期诊断时已开始服用ARB药物或在诊断后1年内开始服用ARB药物。30例已经服用另一种抗高血压药物或在VS诊断后1年内开始服用这种药物，8例未接受任何高血压药物治疗。在随访过程中，没有一个接受ARB治疗的患者在听力上出现任何变化，其他同时伴有VS和高血压的患者组，无论是否接受降压药物治疗，都不可避免地随着时间的推移出现更大的听力损失（Fig7F、G、H、I）。
5.讨论
临床上迫切需求开发有效的治疗方法来保护NF2VS患者的听力功能。据报告，肿瘤纤维化与NF2患者的听力损失相关，该研究着手探究使用氯沙坦进行抗纤维化治疗是否可以改善NF2模型的听力。在恶性癌症中，有充分证据表明异常的促纤维增生性肿瘤组织微环境（TME）会促进疾病进展和治疗抵抗(15,48)。在非恶性NF2VS中，TME在疾病进展中的作用尚未完全清楚。神经鞘瘤主要由肿瘤性雪旺细胞组成，后者是髓鞘和细胞外基质（ECM）的主要生产者，支持神经元存活和轴突生长(49)。研究发现神经鞘瘤中的ECM成分升高。为了减少神经鞘瘤ECM，使用氯沙坦，一种广泛使用的抗高血压血管紧张素受体阻滞剂（ARB）。肾素血管紧张素系统(RAS)最初因其在维持心血管稳态以及体液和电解质平衡中的关键作用而被发现，现在已知可刺激ECM成分的积累(50)。临床上常用的两种主要RAS阻滞剂是血管紧张素转换酶抑制剂(ACEi)和ARBs(50)。与阻断ACEi产生的AngII相比，用氯沙坦阻断AT1受体处的AngII信号传导可能更有效，因为(i)除ACE之外的酶可以产生AngII(51)，(ii)AngII可以独立于AngI和ACE但直接产生来自Ang-(1-12)、AGT的片段和(iii)AT1可以独立于AngII结合而被激活(52)。此外，之前的一项研究表明，氯沙坦比ACEi（赖诺普利）在减少肿瘤的“实体应力”方面更有效(12)。因此，本研究选择使用氯沙坦阻断AT1受体。回顾性研究支持ARB优于ACEI，该研究表明ARB在预防听力损失方面比ACEI更有益。在NF2小鼠模型中，发现氯沙坦有效地使TME正常化：(i)减少神经鞘瘤ECM，(ii)使肿瘤血管系统正常化，以及(iii)增加氧气输送。由于能够使得TME趋于正常化，氯沙坦可预防听力损失并增强放疗疗效。
6.创新点及可借鉴之处
（1）氯沙坦作为抗高血压药物，因其可阻断纤维化和炎症信号，由此在肿瘤治疗中进行尝试并发现其预防听力损失和增强放疗的效果。
（2）氯沙坦在小鼠NF2VS模型中发挥作用，减少神经炎症IL-6/SATAS3信号是其发挥作用的潜在机制之一，氯沙坦是否也存在通过IL-6/STATS3信号通路调控其它疾病的可能？
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