神经损伤通常由外部创伤(如机动车事故、摔跤等)、穿透性创伤以及神经系统病变所导致，包含神经失用、轴突断伤和神经断伤等多种类型。神经损伤可能会导致运动和感觉功能丧失或部分丧失、神经性疼痛、肌肉萎缩，致使患者失去正常的肢体功能甚至是永久性残疾[1]。此外，神经损伤的发病机制错综复杂，通常涉及多种类型细胞的基因调控，轴突变性，星形胶质细胞、Schwann细胞的激活，炎症细胞的浸润等，给临床诊断和治疗方式带来很大的挑战，因此有必要在分子和细胞水平上进一步探索神经损伤的发生和发展进程。而单细胞测序技术的发展能够帮助我们突破传统Bulk测序的限制，提高检测的分辨率，实现在单个细胞层面分析其状态和功能的目的，非常适合应用于具有多种细胞组成、复杂细胞功能、细胞相互作用的领域，目前已受到肿瘤、神经、发育等相关方向研究者的青睐。本文通过展示单细胞测序研究神经损伤的部分已发表研究成果，帮助大家理解该疾病的分子机制。
神经性疼痛
周围神经损伤可导致慢性神经性疼痛，严重影响患者的生活质量，并且临床治疗药物往往具有成瘾性[2]。通过分析神经损伤引起的转录变化有助于我们了解神经性疼痛的复杂发病机制。今年3月，中科院脑科学与类脑研究中心的张旭研究员与李昌林博士对小鼠神经损伤后不同时间点的个DRG细胞(其中个DRG神经元)进行scRNA-seq研究，构建损伤后DRG细胞图谱，发现其中因神经损伤而产生的三种新神经元细胞群高表达Atf3，并展示了这三种细胞群之间的分化关系，以及在神经性疼痛中具体发挥的作用，揭示了神经性疼痛的时间变化模式。研究为理解神经性疼痛发生过程中神经元类型变化的动态过程及其潜在的分子机制、以及为寻找治疗疼痛的潜在靶点提供了新的理解[3]。此外，张旭课题组早在年就通过Smart-seq2分析了小鼠DRG中的神经元[4]，对比两次数据发现，高通量单细胞测序在分析低丰度的细胞亚型方面更具有优势。
小鼠神经损伤后的DRG细胞图谱以及其中神经元细胞的亚群划分[3]
除了小鼠模型，灵长类动物也是神经相关课题中的常见研究对象。JussiKupari等人通过对成年恒河猴的背根神经节进行scRNA-seq，鉴定了灵长类生物的感觉神经元类型，获得9种不同的细胞亚群。同时分析慢性神经性疼痛的细胞起源和遗传性，并揭示不同疼痛状况之间的共有机制[5]。
恒河猴背根神经节的细胞群[5]
此外，也有研究表明神经性疼痛具有遗传性[6]，中科大张智教授课题组在研究中发现MeCP2基因在疼痛的跨代传递中具有重要作用，后续通过单细胞测序发现，小鼠模型的GluS1神经元中多种基因表达发生了变化，其中一些基因受MeCP2调控，佐证了MeCP2在神经性疼痛遗传中的重要地位[7]。
轴突损伤
神经的轴突损伤以及不完整的再生会导致慢性疼痛和其他神经病变，如果我们能更好地理解轴突损伤后神经元过度兴奋的形成机制，可能有助于新的神经性镇痛靶点的开发。WilliamRenthal等人对未处理和不同条件处理(物理损伤和非物理损伤)、不同时间点的成年小鼠的腰椎背根神经节(DRG)进行了单细胞核转录组测序，共获得个细胞核，发现所有体感神经元亚型在周围神经损伤后都发生类似的转录反应，既促进轴突再生又抑制细胞特征，其中ATF3的表达是轴突再生和功能恢复所必须的。研究结果表明神经损伤后早期诱导的转录因子赋予感觉神经元转变为再生状态所需的细胞可塑性[8]。
损伤后不同时间点的DRG神经元中Atf3、Sox11或Sprr1a的表达[8]
炎症反应
神经损伤往往伴随炎症反应的发生，例如在外伤性的周围神经损伤会导致损伤部位和远端神经残端内的无菌炎症，而且先天免疫对于周围神经再生以及调理损伤诱导的背柱轴突再生很重要[9,10]。AshleyLKalinski等人为了分析受损的坐骨神经和轴突切断的DRGs中的细胞组成，对成年小鼠的坐骨神经进行单细胞测序后共计获得个细胞，发现对坐骨神经的压迫性损伤触发了血源性免疫细胞向神经的大量浸润。而轴突切断DRG中的血源性免疫细胞的浸润非常有限，说明神经损伤部位、神经残端和轴突切断DRG之间在炎性景观方面存在显著差异，凋亡性白细胞的胞吞作用被确定为神经清创和消炎的关键机制[11]。
损伤后不同时间点白细胞组成的变化以及损伤后周围神经的细胞图谱[11]
而在中枢神经中，先天免疫介导的氧化损伤与多发性硬化症和其他神经退行性疾病中的神经变性、髓鞘损伤和疾病进展高度相关[12,13]。AndrewS.Mendiola等人为了构建神经炎症疾病中氧化应激先天免疫细胞的图谱，对健康小鼠和慢性EAE小鼠的脊髓进行单细胞测序，发现其中小胶质细胞、浸润性骨髓细胞亚群及MS病变小胶质细胞的核心氧化应激特征都与凝血和谷胱甘肽通路相关。因此推断谷胱甘肽调节化合物acivicin具有有效的治疗作用，降低氧化应激和防止神经变性，并通过小鼠模型验证了该推断[14]。
神经炎症中氧化应激的转录谱分析和治疗靶点寻找[14]
药物引发
顺铂诱导的周围神经病变（CIPN）是在肿瘤化疗中常见的不良反应，也决定了肿瘤治疗的剂量限制。为确定参与CIPN发展的机制，AinaCalls等人对CIPN神经小鼠模型的背根神经节(DRG)感觉神经元进行单细胞RNA测序。结果显示顺铂治疗可诱导DRG神经元群体中DNA损伤反应，上调了Cdkn1a基因以及几种衰老相关酶的表达[15]。
顺铂诱导的周围神经病变与神经元衰老反应相关[15]
损伤修复
为了研究神经系统中巨噬细胞在神经损伤修复中发挥的作用，ElkeYdens等人对小鼠坐骨神经巨噬细胞(snMacs)进行了个体发育、转录组和空间特征分析。发现周围神经系统的巨噬细胞存在2个不同的细胞亚群，分别位于神经内膜和神经外膜，且对神经损伤产生不同的反应。在周围神经挤压损伤的小鼠中内膜巨噬细胞会被激活，并增加其单核细胞吸引趋化因子的产生。募集到受损神经的单核细胞迅速发育成巨噬细胞并表达高水平的Arg1、Chil3和Vegf，发挥神经修复的作用[16]。
神经外膜和神经内膜的巨噬细胞对神经损伤的不同反应[16]
脊髓损伤破坏了大脑和病变下方脊髓之间的轴突连接，在成年哺乳动物中，脊髓损伤会引发瘢痕的形成，导致轴突无法自发再生[17]。为了研究脊髓损伤的愈合机制，哈佛大学何志刚团队构建了小鼠损伤模型，发现相比于成年小鼠，新生小鼠(出生2天)的脊髓修复不伴随瘢痕形成，损伤区域也没有持续的炎症细胞聚集，小胶质细胞被激活并在协调损伤反应及无瘢痕修复中起着关键作用。随后通过单细胞测序分析了损伤后不同时间点的新生小鼠脊髓损伤区域的免疫细胞，其中一类小胶质细胞有促进修复和再生的作用，后续实验通过将新生小鼠的小胶质细胞移植到成年小鼠，也发现能够显著促进脊髓修复和轴突再生。他们的研究展示了如何避免脊髓损伤后瘢痕的形成，为治疗脊髓损伤提供了新的策略[18]。
新生小鼠脊髓损伤区域的免疫细胞随时间点变化情况[18]
结语
鉴于单细胞测序在分析细胞异质性、细胞间相互关系的独特优势，该技术已经成为科研工作者的得力工具，大幅推进了对于疾病分子机制的认知，高效解决了细胞组成分析上的难题。为了帮助大家进一步进行数据挖掘和临床意义解读，新格元搭建了单细胞数据库SynEcoSysTM，定期收录各大主流期刊文章中的细胞类型Marker基因来完善数据库。除了常规的人和小鼠的Marker，还收录了神经领域中常用物种恒河猴的Marker等，能够更加准确的定义相关样本中的细胞。新格元生物科技有限公司作为一家新兴的单细胞测序企业，致力于为客户提供全方位、一站式单细胞测序平台产品，提供优质、专业且全面的服务，让单细胞组学更好的应用于精准医疗和健康管理等领域。
参考文献
[1]MarkL,Wang,Michael,etal.Peripheralnerveinjury,scarring,andrecovery.[J].Connectivetissueresearch,.
[2]CalvoM,DaviesAJ,HLHébert,etal.TheGeneticsofNeuropathicPainfromModelOrganismstoClinicalApplication[J].Neuron,,(4):-
[3]WangK,WangS,ChenY,etal.Single-celltranscriptomicanalysisofsomatosensoryneuronsuncoverstemporaldevelopmentofneuropathicpain[J].CellResearch,.
[4]LiCL,LiKC,WuD,etal.Somatosensoryneurontypesidentifiedbyhigh-coveragesingle-cellRNA-sequencingandfunctionalheterogeneity[J].CellResearch,.
[5]KupariJ,UsoskinD,ParisienM,etal.Singlecelltranscriptomicsofprimatesensoryneuronsidentifiescelltypesassociatedwithchronicpain[J].NatureCommunications.
[6]HigginsKS,BirnieKA,ChambersCT,etal.Offspringofparentswithchronicpain:asystematicreviewandmeta-analysisofpain,health,psychological,andfamilyout